氧化应激在镉抑制小鼠睾丸间质细胞睾酮合成中的作用

朱文祥，刘必勇，刘洪茂，穆柯瀚，姬艳丽，徐德祥

近年来，镉的雄性生殖毒性问题受到越来越多的重视，其生殖毒性作用的主要靶器官是睾丸。镉能引起成年雄性大鼠或小鼠发生明显的睾丸损伤、精子数量和活力降低甚至不育[1-3]。睾酮是一种对雄性生殖系统生长和发育都极为重要的雄性激素[4]。睾酮合成障碍是引起睾丸损伤以及降低精子质量的一个主要因素。本课题组前期研究[5-6]显示，镉暴露会抑制TM3细胞睾酮的合成，其抑制作用可能与镉下调TM3细胞睾酮合成路径中关键酶基因和蛋白的表达有关。但目前对镉通过何种机制下调睾酮合成酶的表达进而抑制睾酮合成尚未清楚。

镉诱导的雄性生殖毒性与氧化应激密切相关[7]。本课题采用TM3细胞作为研究对象，观察镉处理对其睾酮的分泌影响以及氧化应激指标的变化，探讨氧化应激在镉引起的TM3细胞损伤中的作用，为阐明氧化应激影响男性生殖损伤的机制和指导男性生殖健康提供参考依据。

1 材料与方法

1.1细胞培养TM3细胞购自中国科学院上海生命科学研究院，加入2.5%胎牛血清(经灭活)、5%马血清(经灭活)和1%双抗溶液的DMEM/F12培养基，并且在37 ℃、5% CO2的培养箱中贴壁培养。

1.2化学试剂睾酮含量检测ELISA 试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜购于美国Millipore公司；RT和PCR试剂盒购于美国Promega公司；化学物发光增强检测试剂盒购于美国Pierce公司；β-肌动蛋白(β-actin)抗体购于北京博奥森科技有限公司；BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；其他未说明生化试剂均购于美国Sigma公司。

1.3细胞处理待培养瓶中的细胞在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养长至瓶底80%～90%时，以0.25%胰蛋白酶消化，充分混匀后制成约106/ml的细胞悬液。接种一定数目的细胞于培养皿和培养瓶中，分别于特定处理时间后收集细胞上清液和细胞用于睾酮的含量和氧化应激相关指标的检测。

1.4ELISA法检测睾酮含量TM3细胞经20 μmol/L CdCl2处理4 h、8 h后，1 000 r/min离心10 min后收集上清液，用ELISA法检测睾酮的含量。按照ELISA 试剂盒说明书检测步骤操作后，15 min内用酶标仪在波长450 nm处重复测量3次各孔的OD值，并取平均值按照曲线方程计算各孔细胞上清液中睾酮的含量。

1.5Westernblot法检测血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)和血红素加氧酶-2(hemeoxygenase-2,HO-2)蛋白的表达镉处理(4 h、8 h)后收集细胞，刮下贴壁细胞后用RIPA裂解液在冰盒上用搅拌器搅拌裂解5 min，冰上静置裂解20 min左右，4 ℃、15 000 r/min离心15 min，吸取上清液(尽量不要吸到底部的沉淀)于1.5 ml的离心管，置于冰上。采用BCA试剂盒测定裂解液中总蛋白浓度，将蛋白样品用RIPA裂解液稀释定量至同一浓度。细胞蛋白样品与5×上样缓冲液按4 ∶1的比例混合后，在蛋白变性仪上100 ℃、10 min进行蛋白变性。加热变性后的细胞总蛋白样品置于-20 ℃或-80 ℃冰箱中储存待用。样品经SDS-PAGE电泳、转膜后，采用5% 脱脂牛奶封闭后的PVDF膜分别用一抗[β-actin(1 ∶2 000)、HO-1(1 ∶6 000)及HO-2(1 ∶1 000)] 4 ℃孵育过夜，之后用抗小鼠或抗兔IgG[β-actin(1 ∶40 000)、HO-1(1 ∶50 000及HO-2(1 ∶40 000)]于摇床上室温孵育2 h左右。用含0.05% Tween-20的DPBS洗涤3次(10 min/次)，最后再用DPBS洗涤1次(5 min)，之后用Tanon显影仪器(化学发光)检测相关蛋白的表达水平。Western blot结果分析：用内参β-actin将目的蛋白的表达水平标化，将对照组标化后的比值定为1。

1.6RT-PCR法检测氧化应激相关mRNA的表达用20 μmol/L镉处理TM3细胞4 h、8 h后收集细胞提取RNA后吸取一定体积的RNA样品。随后用AMV法对细胞样品RNA进行逆转录。使用氧化应激相关mRNA[SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px、过氧化氢酶(catalase,CAT)]的引物与样品RNA进行扩增反应。使用LightCycler 480 PCR仪，扩增条件为：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s的程序进行45次循环反应。以18S作为内参，使用LightCycler 480 PCR仪统计分析软件对所有的实时定量数据进行相对定量分析。见表1。

表1 基因引物序列

1.7统计学处理采用SPSS 17.0软件单因素方差分析(One-way ANOVA) 进行组间差异的检验，两组间比较用Q检验(Students-Newman-Keuls，SNK) ，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CdCl2处理对TM3细胞睾酮分泌的影响实验结果显示：CdCl2处理TM3细胞4 h和8 h后上清液中的睾酮含量明显低于对照组，差异均有统计学意义(F=140.8,P<0.01)。见图1。

图1 CdCl2对TM3细胞睾酮分泌的影响与对照组比较：**P<0.01

2.2CdCl2处理对TM3细胞抗氧化酶体系mRNA表达的影响结果显示，CdCl2处理组SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px和CAT mRNA的表达水平均呈下降的趋势，其中CdCl2处理8 h组SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px及CAT mRNA的表达水平与对照组比较均下降，差异均有统计学意义(F=12.58、18.89、55.24、91.66、30.32，P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。见图2。

2.3CdCl2处理对TM3细胞HO-1mRNA和HO-1、HO-2蛋白表达的影响与对照组相比，CdCl2处理TM3细胞4 h 后HO-1 mRNA的表达量显著上升(F=545.20,P<0.01)， TM3细胞HO-1 mRNA的表达在CdCl2处理8 h组中进一步增高(图3A) (F=545.20,P<0.01)；HO-1蛋白在CdCl2处理的TM3细胞中被显著诱导表达，并且随着CdCl2处理时间的增加，这种诱导的作用更加明显(图3B) (F=588.70,P<0.01)；TM3细胞中HO-2蛋白的表达量与其被CdCl2染毒前后无明显相关(图3C)。

3 讨论

睾丸间质细胞是睾丸中的内分泌细胞，其主要功能是合成和分泌睾酮。睾酮对男性正常生殖功能的维系尤为重要。动物体内研究[6]结果表明，镉能够损害睾丸发育，减少精子发生，其可能与镉抑制睾酮的合成和分泌有关。本课题组采用TM3细胞的体外研究表明，镉处理组TM3细胞的睾酮含量明显低于对照组，提示其能抑制TM3细胞中睾酮的分泌和合成。

图2 CdCl2处理后TM3细胞抗氧化相关酶mRNA的表达A：SOD1；B：SOD2；C：SOD3；D：GSH-Px；E：CAT；与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

图3 CdCl2处理后对TM3细胞HO-1和HO-2表达的影响A：HO-1 mRNA；B：HO-1；C：HO-2；与对照组比较：**P<0.01；与4 h组比较：##P<0.01

许多研究已表明，氧化应激在镉引起的雄性生殖毒性中发挥重要作用。SOD在机体暴露于氧化应激时可被迅速诱导，能催化超氧化物自由基歧化(或分配)成分子氧和过氧化氢。CAT是绝大部分需氧生物体中的常见酶，可以将过氧化氢分解成分子氧和水，保护细胞免受氧化损伤[8]。在大量研究中，当生物体遭受环境化学物质诱导的氧化应激时，SOD和CAT的活性及其基因的转录会发生改变[9]。除SOD和CAT以外，谷胱甘肽(GSH)是动物中最重要的硫醇化合物，可以保护细胞避免其受氧化损伤[10]。本研究显示，镉处理组的TM3细胞SOD1、 SOD2、 SOD3、 GSH-Px和 CAT mRNA表达降低。提示镉抑制TM3细胞抗氧化酶的表达，使其发生氧化应激并造成损伤，并可能损害其睾酮合成的功能。

HO-1由HMOX1编码，是一种能将血红素降解成一氧化碳(CO)，亚铁离子(Fe2+)和胆绿素并具有抗凋亡和抗炎的细胞保护性酶，参与各种病理生理过程[11]。许多研究提出，HO系统的活性能提供细胞保护来抵抗氧化应激。HO-1为诱导型酶，正常情况下体内表达很低，但在应激或炎症发生等情况下， HO-1被诱导表达以维持机体的内环境稳态[12-13]。值得注意的是，HO-1的诱导并不全是对机体有益的。有研究[14]表明HO-1的过表达可导致体外和体内模型中的肌肉损伤，导致骨骼肌萎缩，且HO-1的缺乏明显减轻了肌肉萎缩。在睾丸组织中，HO-1在睾丸间质细胞中仅少量表达，而镉应激诱导TM3细胞HO-1大量表达，提示其可能在其致睾丸的生殖毒性中发挥作用。在MA-10 Leydig肿瘤细胞中，HO同工酶降低了类固醇合成急性调节蛋白水平，并且氯化血红素处理抑制了胆固醇向孕烯醇酮的转化[15]。本研究结果表明，HO-1在镉诱导的 TM3细胞中明显表达并可能参与了睾酮分泌的抑制过程。