跳骨片调控Wnt/β-catenin信号通路延缓骨关节炎关节软骨退变的机制研究

何晓娟 郑文伟 贾良良 李慧 许丽梅 曾建伟 许惠凤 郑春松 叶锦霞 吴广文 李西海 叶蕻芝

【摘 要】目的：探讨跳骨片调控Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路保护骨关节炎关节软骨的机制。方法：将30只2月龄雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、跳骨片组，每组10只。采用改良Hulth法建立骨关节炎动物模型。造模成功后跳骨片组给予跳骨片0.32 g·kg-1·d-1灌胃，空白对照组和模型对照组给予等量生理盐水灌胃，干预12周后取大鼠关节软骨。Real-time PCR检测关节软骨β-catenin、Frizzled-2、GSK-3β、CKIε mRNA表达，Western blot法检测关节软骨CKIε、CollagenⅡ、PGS1蛋白表达，Massion染色法观察3组关节软骨胶原的表达及形态变化。结果：Real-time PCR结果显示，与空白对照组比较，模型对照组关节软骨β-catenin、Frizzled-2、CKIε mRNA表达明显上升（P < 0.05，P > 0.05，P < 0.05），而GSK-3βmRNA表达明显下降（P < 0.05）;与模型对照组比较，跳骨片组关节软骨β-catenin、Frizzled-2、CKIε mRNA表达明显下降（P < 0.05，P > 0.05，P < 0.05），而GSK-3β mRNA表达明显上升（P < 0.05）。Western blot结果显示，与空白对照组比较，模型对照组关节软骨CKIε蛋白表达明显升高（P < 0.05），而CollagenⅡ、PGS1蛋白表达明显降低（P < 0.05，P < 0.01）;与模型对照组比较，跳骨片组关节软骨CKI-ε蛋白表达明显降低（P < 0.05），CollagenⅡ、PGS1蛋白表达明显升高（P < 0.01，P > 0.05）。Massion染色结果显示，空白对照组和跳骨片组关节软骨结构清晰，软骨层染色明显，软骨组织呈淡蓝色，胶原含量较高;模型对照组软骨层结构紊乱，染色较浅，胶原含量低。结论：跳骨片能调控Wnt/β-catenin信号通路抑制骨关节炎炎症反应，促进细胞外基质的合成，保护关节软骨。

【关键词】 骨关节炎;关节软骨;跳骨片;Wnt/β-catenin信號通路;大鼠

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以进行性软骨变性为特征的退行性关节病。由于成年人关节软骨的再生能力有限，OA已成为全世界残疾的主要原因之一[1]。OA的主要特征为软骨细胞肥大、炎症因子分泌增多、关节软骨逐渐破坏，以及软骨基质丢失。软骨退变是其中最为主要、严重的病理改变[2-3]。OA与关节软骨细胞外基质合成分解代谢失衡密切相关，维持细胞外基质的稳定对于延缓关节软骨退变至关重要。Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号转导通路和软骨的发育、形成、修复，及软骨的丢失有着密切联系。β-catenin是该通路系统起关键作用的调控蛋白，它在细胞内逐渐积聚达到一定水平会激活下游通路靶基因的表达，加速OA病情发展。本课题组前期研究发现，跳骨片可以降低OA大鼠滑膜中炎症因子的表达，降低OA炎症反应，抑制软骨基质降解[4]。本文通过跳骨片干预OA动物模型，观察软骨基质主成分表达的变化，旨在探讨跳骨片保护关节软骨的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 2月龄雄性SPF级SD大鼠30只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号SCXK（沪）2012-0002。实验动物处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 实验试剂与仪器 跳骨片（福州屏山制药有限公司）;质量分数为10%的水合氯醛（上海士锋生物科技有限公司）;TBST（康为世纪有限公司）;山羊抗兔IgG/HRP（博奥森生物技术有限公司）;CKI-ε抗体（美国Santa Cruz公司）;PGS1抗体（美国Sigma公司）;β-actin抗体、CollagenⅡ抗体（美国Abcam公司）;RIPA裂解液（强）、蛋白上样缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司）;LX-800酶标仪（美国Bio-tek公司）;RNA浓度测定仪（美国Thermo公司）;荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

2 方 法

2.1 分组及造模方法 将30只SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、跳骨片组，每组10只。模型对照组、跳骨片组采用改良Hulth法复制OA模型：质量分数为10%的水合氯醛对大鼠进行麻醉，膝关节内侧切口暴露关节腔，切断内侧副韧带、前交叉韧带，切除半月板，针线对内外皮逐层缝合[5]。术后连续3 d 20万U青霉素肌肉注射预防感染。

2.2 给药及取材方法 跳骨片粉碎后，用生理盐水配成0.032 g·mL-1的混悬液。术后1周，根据人和动物药物等效剂量换算[6]，跳骨片组大鼠给予跳骨片溶液0.32 g·kg-1·d-1灌胃，空白对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃。连续灌胃12周后，取关节滑膜，并用刀切取胫骨平台及股骨髁的软骨，-80 ℃存储备用。

2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）

检测关节软骨β-catenin、Frizzled-2、GSK-3β、CKIε mRNA表达 将关节软骨置于干净的研钵中，加入液氮后研磨成粉末，加适量Trizol提取3组总RNA。取2 μg总RNA，按Thermo Fermentas反转录试剂盒说明书进行逆转录。取2 μL逆转录产物，按AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix试剂盒说明书进行加样，使用ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪进行荧光收集，其中引物序列见表1。以GAPDH为内参基因，并用2-△△Ct值比较3组间的基因表达差异。

2.4 Western blot法检测关节软骨CKIε、CollagenⅡ、PGS1蛋白表达 取软骨组织置于干净的研钵中，加入液氮并研磨成细粉，按1 g∶4 mL加入RIPA蛋白裂解液进行冰上裂解，每30分钟震荡1次，2 h后吸取裂解液，离心机以14 000 r·min-1离心30 min，吸取200 μL上清液于EP管中，加入50 μL蛋白上样缓冲液，100 ℃加热变性5 min。根据BCA蛋白定量结果加样，体积分数为10%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳2.5 h，转膜，封闭，分别孵育CKI-ε、CollagenⅡ、PGS1一抗，4 ℃过夜，TBST洗3次，每次10 min，室温孵育二抗1 h，TBST洗3次，曝光显影。采用凝胶图形分析软件Image Lab对显影后的蛋白条带灰度值进行分析。

2.5 Masssion染色法观察关节软骨 常规脱蜡经蒸馏水洗，切片经苏木精核染5～10 min，蒸馏水冲洗1 min，体积分数为1%的盐酸乙醇分化，浸入温水返蓝数分钟;然后将切片用丽春红酸性品红液处理7 min，并浸入质量分数为2%的冰醋酸中5 s;用质量分数为1%的磷钼酸分化10 min，不水洗直接入苯胺蓝液复染5 min;用质量分数为2%的冰醋酸处理5 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察拍照。

2.6 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。3组关节软骨Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及基因表达水平的组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 3组关节软骨β-catenin、Frizzled-2、GSK-3β、CKI-ε mRNA表达水平比较 与空白对照组比较，模型对照组关节软骨中β-catenin、Frizzled-2、CKI-ε mRNA表达明显上升（P < 0.05，P > 0.05，P < 0.05），而GSK-3β mRNA表达明显下降（P < 0.05）;与模型对照组比较，跳骨片干预后，关节软骨中β-catenin、Frizzled-2、CKI-ε mRNA表达明显下降（P < 0.05，P > 0.05，P < 0.05），而GSK-3β mRNA表达明显上升（P < 0.05）。见表2。

3.2 3组关节软骨CKI-ε、PGS1、CollagenⅡ蛋白表达水平比较 与空白对照组比较，模型对照组关节软骨CKI-ε蛋白表达明显升高（P < 0.05），而CollagenⅡ、PGS1蛋白表达明显降低（P < 0.05，P < 0.01）;与模型对照组比较，跳骨片组关节软骨CKIε蛋白表达明显降低（P < 0.05），CollagenⅡ、PGS1蛋白表达明显升高（P < 0.01，P > 0.05）。见表3。

3.3 3组关节软骨的Masson染色 空白对照组和跳骨片组关节软骨结构清晰，软骨细胞密集，软骨层染色明显，软骨组织呈蓝绿色，胶原含量较高。模型对照组软骨层结构紊乱，软骨表面粗糙，有裂隙，染色较浅，胶原含量低。

4 讨 论

OA属中医学“痹证”范畴，其病在筋骨，病位在肝肾。肝藏血，主筋;肾藏筋，主骨;老年肝邪，邪滞膝部，气滞血瘀，经络闭阻;本痿标痹为本病的核心病机，肝肾亏虚，筋骨失养而为痿，腠理空虚易感风寒湿之邪而为痹[7]。基于OA的病理特点，临床上提出“治痿、治痹、痿痹同治”的治疗理念，因此治当以补益肝肾、强筋壮骨为主（治痿），祛风通络、除湿散寒为辅（治痹）[8]。跳骨片是由马钱子（制）、冰片、乌药、狗脊、黄芪等20味中药制成的糖衣片剂，其中马钱子（制）、冰片具有抗炎镇痛功效，三七、土鳖虫、红花等具有活血通络、祛风散寒的作用，冰片、羌活、乌药等主要有消肿定痛功效。诸药合用，共奏活血舒筋、祛风除湿散寒的功效。

OA微观病理表现为炎症因子的大量产生，进一步破坏软骨基质稳态失衡，最终导致软骨退变;因此，抑制炎症因子的产生，促进软骨基质合成，已成为治疗OA的一种思路。关节软骨是由一种细胞类型（软骨细胞）组成的，并被包封在细胞外基质中的联合组织[9]。软骨细胞可合成、分泌细胞外基质，而胶原（Ⅱ型占90%以上）和蛋白聚糖是構成细胞外基质主要成分，胶原能构成关节软骨内的纤维网架结构，蛋白聚糖能够维持关节软骨良好弹性，软骨基质是软骨细胞汲取营养物质和传递信号的载体，其代谢平衡维持着关节软骨的生物学性能[10-11]。OA的特征为关节软骨退化，在这个过程中软骨细胞发生进行性凋亡，软骨基质结构遭到破坏，含量减少，尤其是Ⅱ型胶原和蛋白多糖的减少。

β-catenin是Wnt经典信号通路的关键性调控蛋白，在正常未受刺激的细胞中无Wnt信号，胞质内β-catenin大部分与细胞膜上钙黏着蛋白结合，使之附着于细胞骨架蛋白肌动蛋白上，介导同型细胞间黏附[12]。Wnt经典信号通路是以Wnt/β-catenin/Tcf为主线的信号通路，在没有Wnt信号传导的情况下，活性GSK-3β使β-catenin磷酸化，导致其泛素化和蛋白酶体降解[13]。当Wnt信号被激活后，Wnt与Frizzled和LRP5/6结合，经信号传导给胞质蛋白Dsh，Dsh可抑制GSK-3β的活性。CKI-ε是Wnt通路正向调节因子，当Wnt信号被激活时，Wnt配体中的一些家族成员与相应受体结合可活化CKI-ε，经过多次生物信号传递过程，最终抑制GSK-3β对β-catenin的磷酸化降解[14]。未磷酸化的β-catenin在胞质中聚集达到一定浓度后进入细胞核，随后与T细胞因子（Tcf/Lef）结合形成β-catenin-Tcf/Lef，β-catenin-Tcf/Lef转录促进基质金属蛋白酶（MMPs）等许多靶基因的表达。课题前期研究发现，跳骨片可上调大鼠关节软骨Wnt-4、β-catenin的蛋白表达，降低滑膜中TNF-α、IL-1β、MMP-13等炎症因子的表达，抑制OA炎症反应[4]。荧光定量PCR、Western blot结果显示，跳骨片干预后，大鼠关节软骨中β-catenin、Frizzled-2、CKI-ε mRNA表达水平明显下降，GSK-3β mRNA表达水平明显上升;与模型对照组比较，空白对照组和跳骨片组的CKI-ε蛋白表达水平下调，PGS1、Collagen表达水平上调，提示跳骨片可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进软骨基质的合成。

本研究结果显示，跳骨片可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进关节软骨Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达，维护软骨基质稳态环境，对关节软骨具有一定的保护作用;然而其具体作用靶点尚未清晰，还需后期深入研究。

5 参考文献

[1] 刘献祥，李西海，周江涛.改良Hulth造模法复制膝骨性关节炎的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2005，25（12）：1104-1108.

[2] 黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9（9）：1069-1072.

[3] RIBITSCH I，MAYER RL，EGERBACHER M，et al.Fetal articular cartilage regeneration versus adult fibrocartilaginous repair：secretome proteomics unravels molecular mechanisms in an ovine model[J].Dis Model Mech，2018，11（7）：33092.

[4] DE KROON LMG，VAN DEN AKKER GGH，BRACHVOGEL B，et al.Identification of TGF β-related genes regulated in murine osteoarthritis and chondrocyte hypertrophy by comparison of multiple microarray datasets[J].Bone，2018，33（116）：67-77.

[5] GLYN-JONES S，PALMER AJ，AGRICOLA R，et al.Osteoarthritis[J].Lancet，2015，386（9991）：376-387.

[6] 郑文伟，马玉环，陈后煌，等.跳骨片抑制大鼠膝骨关节炎Wnt/β-catenin信号转导通路介导炎症反应的机制研究[J].国际骨科学杂志，2017，38（1）：60-64.

[7] 李西海，刘献祥.补肾壮筋汤干预肝肾亏虚型膝骨性关节炎软骨退变的机制探讨[J].福建中医药，2011，42（5）：58-59.

[8] 李西海，陈后煌，叶蕻芝，等.补肾柔肝法治疗骨关节炎筋骨失养的作用探讨[J]. 风湿病与关节炎，2016，5（6）：40-42.

[9] 何晓娟，李慧，许丽梅，等.microRNA调控骨关节炎软骨基质稳态失衡的机制探讨[J].风湿病与关节炎，2018，7（1）：53-57.

[10] 吴浩，孟志超，曹永平，等.内质网应激对膝骨关节炎大鼠关节软骨细胞的影响[J].中国组织工程研究，2017，21（16）：2502-2508.

[11] 李彦林，王国梁，曹斌，等.体外阻断基质细胞衍生因子1/CXC趋化因子受体4信号通路后人关节软骨组织Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达[J].中国组织工程研究，2012，16（46）：8607-8610.

[12] 李西海，梁文娜，刘献祥.毫米波干預软骨细胞β-catenin活性作用机制研究[J].科技导报，2009，27（21）：32-38.

[13] 李宝新，李玉坤.Wnt信号通路对骨调节研究新进展[J].国际骨科学杂志，2008，29（3）：179-181.

[14] CHUN JS，OH H，YANG S，et al.Wnt signaling in cartilage development and degeneration[J].Bmb Reports，2008，41（7）：485-494.

收稿日期：2018-09-07;修回日期：2018-10-29