Janus激酶/信号传导和转录激活蛋白3通路阻断对新生大鼠缺氧缺血性脑病的影响

陈惠军

(新乡医学院附属新乡市中心医院儿科，河南 新乡 453000)

近年来，对Janus激酶/信号传导和转录激活因子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT)通路的研究主要集中在肝脏、心脏、肾脏及淋巴系统疾病和肿瘤等，而对其在脑缺血损伤中作用的研究较少[1]。研究显示，JAK/STAT通路在调节脑缺血后细胞因子的反应中具有重要作用，STAT3可以激活miR-21的表达，进而影响细胞存活与发展[2]。新生儿缺氧缺血性脑病 (hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是各种原因引起脑组织缺血缺氧，造成神经细胞凋亡与坏死，导致神经功能低下而成为永久性的损害[3-4]。有关JAK/STAT通路在缺血性脑损伤中的作用尚存在争议，有学者认为其可以发挥保护神经细胞的作用[5]，也有学者认为其可导致神经细胞凋亡[6]。因此，探讨JAK/STAT通路在HIE发病机制中的作用对进一步防治HIE具有重要意义。本研究在建立新生大鼠HIE模型的基础上，观察阻断JAK/STAT3通路对新生大鼠HIE发生、发展的影响，为HIE的基因治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1实验动物7日龄清洁级新生Wistar大鼠70只，体质量11～18 g，雌雄不限，由郑州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2007-0001。

1.2主要试剂与仪器STAT3、微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)(美国Abcam公司)，JAK/STAT3信号通路阻断剂AG490(美国Sigma公司)；实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(美国Bio-Rad公司)，Eppendorf移液器(德国Eppendorf公司)，DYY-III型电泳槽(北京六一仪器厂)，SW-CJ-ZFD超净工作台(苏州净化设备有限公司)，325型旋转切片机(英国Shandon 公司)，Nikon-E400光学显微镜(日本尼康公司)。

1.3实验分组与处理将70只新生大鼠随机分为对照组(10只)、HIE组(30只)和干预组(30只)。HIE组和干预组新生大鼠根据文献[7]中的方法制备HIE模型：乙醚麻醉新生大鼠，颈部正中切开皮肤，暴露并结扎左颈总动脉2 h，而后恢复2 h；然后置于37 ℃恒温水浴缺氧舱中，输入混合气体(含体积分数8%的氧气和92%的氮气)，2 h后取出新生大鼠，由母鼠喂养。干预组新生大鼠于造模型前 10 min 腹腔注射JAK/STAT信号通路阻断剂AG490 3 mg·kg-1。对照组新生大鼠仅行左颈总动脉分离，不做结扎和缺氧处理。

1.4组织标本采集HIE组和干预组新生大鼠分别于造模后6、48、72 h处死，每组每个时间点处死10只；对照组新生大鼠于48 h时全部处死。大鼠行乙醚麻醉后开胸，经心先后灌注磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)和40 g·L-1多聚甲醛，断头，取大脑海马(CA1区)组织。标本分为2份，一份置于液氮中保存，待行PCR检测；另一份用于组织病理学观察。

1.5新生大鼠海马组织病理学观察取海马组织，置于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h；常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明；石蜡包埋，切片(片厚约4 μm)，脱蜡至水；行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察大鼠海马组织病理学改变。

1.6实时荧光定量PCR检测大鼠海马组织中miR-21和STAT3mRNA的表达取适量脑组织，利用TRIzol提取总RNA，反转录合成cDNA。反应体系：RNA 5 μL、N6 Rnadom Primer 0.8 μL、上游和下游引物(10 mmol·L-1)各1 μL，三磷酸脱氧核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)0.4 μL、反转录酶0.3 μL、RNasin 0.4 μL、5×缓冲液4 μL，补充焦碳酸二乙酯水至20 μL。混匀反应液，放入37 ℃水浴中1 h。94 ℃ 3 min灭活反转录酶。PCR扩增产物，反应体系：cDNA模板5 μL、dNTP(10 mmol·L-1)0.2 μL、上游和下游引物(10 mmol·L-1)各1 μL、10×PCR缓冲液2.5 μL、MgCl2(50 mmol·L-1)0.7 μL、50×SYBR Green 0.12 μL、Taq DNA聚合酶(2 500 kU·L-1)0.4 μL，补充双蒸水至25 μL。反应条件：37 ℃ 2 min，94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环重复40次。引物序列由北京奥科生物技术有限责任公司合成，以U6作为miR-21内参，β-actin作为STAT3内参。miR-21引物序列(70 bp)：上游为5′-GAAATGCCTCACAGCTATCGT-3′，下游为5′-CCT-CCACAAAGAGCCACC-3′；U6引物序列(75 bp)：上游为5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，下游为5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′；STAT3引物序列(306 bp)：上游为5′-ACAGGTTTCCAGCACGC-3′，下游为5′-CATCGAGAAAGAGTCTACG-3′；β-actin引物序列(197 bp)：上游为5′-CGTGCAGGCATC-CGGCACGC-3′，下游为 5′-TGGCATAAGGTGAAC-AAGTACAG-3′。采用2-ΔΔCt法[8]分析miR-21和STAT3的相对表达量。

2 结果

2.13组新生大鼠海马组织病理学改变结果见图1。对照组新生大鼠海马组织中神经元、小胶质细胞的大小、形态均正常，未见细胞变性及水肿现象。造模后48 h，HIE组新生大鼠海马组织中神经元体积增大，中度水肿，着色不均；干预组新生大鼠海马组织中神经元体积增大，中、重度水肿，着色不均，可见细胞核固缩，并见小胶质细胞轻度增生，间质水肿。

A：对照组；B：HIE组造模后48 h；C：干预组造模后48 h。

图13组新生大鼠海马组织病理学改变(HE染色，×400)

Fig.1Histopathologicalchangesinhippocampaltissuesofneonatalratsinthethreegroups(HEstaining，×400)

2.23组新生大鼠海马组织中miR-21和STAT3mRNA相对表达量比较结果见图2、图3和表1。造模后6、48、72 h，HIE组和干预组大鼠海马组织中miR-21、STAT3 mRNA相对表达量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；干预组大鼠海马组织中miR-21、STAT3 mRNA相对表达量显著低于HIE组，差异有统计学意义(P<0.05)。HIE组和干预组大鼠造模后48 h海马组织中miR-21、STAT3 mRNA相对表达量显著高于造模后6、72 h，差异有统计学意义(P<0.05)；HIE组和干预组大鼠造模后6 h与造模后72 h海马组织中miR-21、STAT3 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

M：Marker；1、2、3：HIE组造模后72、48、6 h；4、12：对照组；5、6、7、8：U6；9、10、11：干预组造模后72、48、6 h。

图23组新生大鼠海马组织中miR-21的表达

Fig.2ExpressionofmiR-21inhippocampaltissuesofneonatalratsinthethreegroups

M：Marker；1、5：对照组；2、3、4：HIE组造模后6、48、72 h；6、7、8：干预组造模后6、48、72 h。

图33组新生大鼠海马组织中STAT3mRNA的表达

Fig.3ExpressionofSTAT3mRNAinhippocampaltissuesofneonatalratsinthethreegroups

表13组新生大鼠海马组织中miR-21及STAT3mRNA表达比较

组别nmiR-21STAT3 mRNA对照组101.01±0.221.52±0.31HIE组 造模后6 h103.87±5.42a3.67±5.13a 造模后48 h106.33±2.15ac5.01±3.26ac 造模后72 h103.16±3.41a3.21±0.12a干预组 造模后6 h102.12±2.43ab2.08±4.12ab 造模后48 h103.28±4.65abc3.01±3.26abc 造模后72 h102.18±4.46ab1.87±0.12ab

注：与对照组比较aP<0.05；与HIE组比较bP<0.05；与造模后6、72 h比较cP<0.05。

3 讨论

缺氧缺血性脑损伤是一个复杂的病理生理过程，是造成神经细胞损伤坏死的重要原因[9-10]。研究表明，JAK/STAT信号通路与缺氧缺血性脑损伤密切相关，并影响其发展与转归。STAT3是JAK/STAT信号通路中的关键性基因，在HIE、肿瘤、脑损伤等疾病的发生、发展中起主导作用[11]。miR-21是重要的癌基因，在多种肿瘤的发生和发展中呈现高表达[12-13]。有研究显示，HIE新生儿血清miR-21水平升高[4]。采用生物信息学方法对 miR-21和STAT3靶向配对，进行相关性的预测，结果发现二者配对关系密切，STAT3可以直接激活miR-21[14-15]。

本研究结果显示，对照组新生大鼠海马组织形态学正常，HIE组和干预组大鼠海马组织出现显著病理学改变，而干预组大鼠海马组织病理学改变较HIE组更严重；HIE组大鼠海马组织中STAT3 mRNA相对表达量显著高于对照组，而干预组大鼠海马组织中STAT3 mRNA相对表达量显著低于HIE组。缺氧缺血后大鼠海马组织中JAK/STAT3信号通路被激活，STAT3被激活后诱导细胞周期调控基因与抗凋亡基因的表达；miR-21调控细胞增殖，减少细胞凋亡；因此，STAT3和miR-21表达升高可能对脑神经细胞起到一定的保护作用；阻断JAK/STAT3信号通路后STAT3表达降低，失去对miR-21的有效调控，miR-21也随之降低，此时，受到miR-21抑制的靶基因如PDCD4、PTEN、TIMP3等表达上调，脑神经细胞受到PDCD4等基因的调控，出现变性坏死；因此，阻断JAK/STAT 信号通路可能会对脑组织造成进一步损害[16]。本研究结果与LIN等[5]实验结果基本一致。

综上所述，脑组织缺氧缺血时STAT3和miR-21表达上调，其可能对神经细胞起到应激性保护作用，这一作用可以被JAK/STAT3信号通路阻断剂AG490阻断。激活JAK/STAT3信号通路有望成为临床治疗HIE的新靶点。