细胞穿膜肽药物载体研究进展

岳瀚勋，余 娴

(1.重庆医科大学药学院，重庆 400010；2.重庆医科大学附属第二医院Ⅰ期临床试验研究室，重庆 400010)

细胞在摄取物质时具有一定的选择性，疏水性小分子化合物易于透过细胞膜，而强极性、亲水性和难溶性化合物只有在相关载体的帮助下才能通过，使得一大部分具有良好应用前景的生物活性分子(如蛋白质、多肽和寡核苷酸等)因为亲水性问题而难以透过细胞膜，限制了其临床应用。但这些生物活性分子的优点又是突出的，它们通常具有较高的特异性、耐受性和功效[1-2]。为了能够更好地应用这些活性分子，寻找一种合适的载体成为当务之急。20多年前，FRANKEL等[3]从人类免疫缺陷病毒1中提取到转录活化因子(trans-activating transcriptional activator，TAT)蛋白，并发现其具有穿透细胞膜的活性，此后一大批具有类似活性的短肽被发现，这些短肽被形象地称为细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)，也叫蛋白转导域。相比于电穿孔、磁转染、脂质转染和病毒载体等，CPP以其穿膜效率高、细胞毒性低、可以携带各种生物活性分子(包括纳米颗粒)等优点得到了研究者的广泛关注。作为潜在的药物载体，目前关于CPP的序列组成、理化性质、内化机制、内体逃逸和靶向性等方面的研究得到了极大发展[4-5]。目前已发现的CPP有上千种，根据其物理化学特性可以分为3种类型：(1)阳离子型，如TAT、穿膜素Penetratin、聚精氨酸Polyarginine等；(2)两亲型，如模型两亲肽(model amphiphilic peptide，MAP)；(3)疏水型，如成纤维细胞生长因子12[6]。CPP的穿膜效率虽然普遍较高，但也存在一些突出问题，如在体内应用时发现，通过荧光等技术标志的CPP在体内循环时因抗蛋白酶水解能力较差，有部分降解，甚至绝大部分降解[7]；此外，CPP内吞穿膜后因内体逃逸率较低造成大部分被束缚在囊泡(内体)中而无法到达细胞质和细胞核中[8]；最关键的是，CPP可以穿过任何哺乳动物细胞的细胞膜，从而导致未经修饰的CPP的靶向性极差，极大地限制了其作为药物载体的临床应用[9]。以上问题造成了CPP到达靶组织或靶细胞的量大大减少，从而导致药物的作用降低。为了完善CPP作为药物载体的功能，各种改进方法逐渐见诸报道。本文就CPP的抗蛋白酶水解稳定性、内体逃逸和靶向性策略3个方面的研究进展进行综述，以期为CPP的改进提供新的思路。

1 CPP的抗蛋白酶水解稳定性

通过与CPP共价连接或非共价结合介导的药物输送目前得到了广泛的研究关注。但因CPP抗蛋白酶水解能力较差，造成其在血液循环中以及通过上皮细胞酶促屏障或内皮细胞时被快速代谢清除，从而导致CPP携载的药物无法被运送到目的组织或细胞。SARKO等[10]分别比较了人血清中和pc-3荷瘤裸鼠体内与1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸 嵌合的10种常用CPP，包括penetratin、TAT、乙肝病毒表面蛋白PreS2转位基序、MAP、九聚精氨酸、膜转运序列(membrane transduction sequence，MTS)、核定位信号(nuclear localization signal，NLS)等的稳定性，血清实验结果显示，除了MAP和MTS外，其他CPP半衰期均< 8 h，而裸鼠体内的实验结果显示所有CPP被快速清除。该研究还发现，精氨酸-精氨酸键(RR键)是影响其稳定性的关键因素，且可以通过将CPP连接到大分子载体(如纳米颗粒或脂质体)上使其清除降低；此外还可以通过修饰穿膜肽本身来增加其稳定性。有研究者通过在CPP侧链修饰α/β折叠肽和内酰胺装订肽，一定程度上增加了蛋白酶稳定性[11-13]；WOLFE等[14]提出，可以通过将CPP骨架双环化来增加稳定性。然而，鉴于CPP是一种具有转导能力的载体，在某些情况下侧链修饰和骨架环化会影响其运载药物的能力，因此单独增加CPP的稳定性缺乏实际意义。迄今，较有应用价值的增加CPP稳定性的策略是采用D型非天然氨基酸替换穿膜肽序列中的L型氨基酸来增加其稳定性，但不足的是非天然氨基酸会带来较高的毒性[15-16]。马严[17]构建了一类混合不同数目D型氨基酸和L型氨基酸的寡聚精氨酸R8，并研究了其生物稳定性(酶稳定性和血清稳定性)，结果发现，D型精氨酸数目越多寡聚精氨酸R8的抗酶解能力越高，D型氨基酸数目超过3个以上时这种趋势不再明显；而随着D型氨基酸数目的增加，寡聚精氨酸R8的生物毒性(细胞毒性和系统毒性)也随之增加，穿膜肽肽链中的D型精氨酸数目≤2个时，D型精氨酸带来的额外毒性并不明显；当穿膜肽肽链中的D型精氨酸数目≥3个时，穿膜肽的系统毒性开始显著增加。因此，可以选择不明显增加毒性的相应数目的D型氨基酸来增加CPP的稳定性。

2 CPP的内体逃逸

关于CPP具体的穿膜机制一直存在争论，一般认为主要有2种穿膜方式：胞吞作用穿膜和非胞吞作用的直接穿膜。目前，大部分的实验研究支持胞吞作用穿膜，但经过胞吞作用进入细胞的货物分子(CPP和生物活性分子)会被束缚在囊泡(内体)中而无法发挥功能，而且长期被束缚在囊泡中，囊泡与溶酶体结合后的酸性环境以及其所包含的各种酶会进一步使货物分子失活或者降解[8]。所以CPP进入细胞后的囊泡束缚成为了CPP应用中面临的大问题。对于该问题的解决策略主要是通过适当的方法使内吞形成的囊泡破裂而释放出货物分子，如通过加入额外的促囊泡渗漏试剂或者修饰穿膜肽使其带有破坏囊泡膜的结构等。目前发现的促囊泡渗漏试剂有芘丁酸、聚阳离子肽dfTAT等，将寡聚精氨酸穿膜肽与它们共孵育，结果显示均能够在细胞水平提高穿膜肽的内体逃逸率[18-19]；NEUNDORF等[20]将具有破坏内体膜活性的人流感病毒HA2的N末端片段与CPP共价结合，研究其是否能够改善穿膜肽的内体逃逸，结果显示，HA2的N末端片段能够增加CPP的内体逃逸并增加其在细胞质内的分布，但同时也明显增加了CPP的毒性。此外，也有研究者利用组氨酸的咪唑基团在酸性环境下质子化促进胞吞泡溶胀破裂的策略来增加CPP的内体逃逸[21]。除了以上策略，有研究者将CPP与脂质体融合，利用脂质体在酸性条件下与胞吞泡膜融合来促进货物分子的内体逃逸[22]。关于改善内体逃逸的尝试有很多，但因CPP的穿膜机制尚未定论，所以每种尝试均有其不足之处，需要在应用CPP时具体考虑。

3 CPP的靶向性

CPP自被发现以来，便以其穿膜效率高、细胞毒性低等特点得到了药学研究者的青睐，被认为是一种有希望的潜在药物载体，但因为其缺乏选择性，阻碍了其在临床的应用。由于CPP对细胞的选择性低，单凭CPP无法使药物定向蓄积，使作用于靶细胞或靶组织的药物浓度减少，对正常组织的损伤增大[23-24]，因此，如何增加CPP的靶向性成为亟待解决的问题。近10余年来，关于靶向载药CPP的研究主要集中在肿瘤方面，其中绝大部分研究思路是利用不同“刺激-响应”策略来控制载药CPP进入肿瘤细胞。在肿瘤组织特异性因素的促发下，无穿膜活性的载药CPP变为有穿膜活性的载药CPP，使其得以选择性进入肿瘤细胞，从而减低不良反应并提高抗肿瘤疗效[25-26]。无穿膜活性的载药CPP主要通过静电作用获得：CPP富含极性带正电荷的碱性氨基酸，故为多聚阳离子，其与带负电荷的细胞膜具有高度亲和力[27]；而通过静电作用中和CPP的正电荷后，CPP的穿膜活性将显著减弱。因此，静电作用应用于载药CPP可显著减少载药CPP进入非肿瘤组织[28-29]；反之，当其进入肿瘤组织，肿瘤组织特异性因素促发静电作用消失后，CPP可恢复正电荷进而恢复穿膜活性。

3.1基于肿瘤微环境高表达酶设计的靶向载药CPP系统2004年，JIANG等[30]首次报道了肿瘤靶向基质金属蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase 2/9，MMP 2/9)响应的载药CPP系统，又称为可活化CPP系统 (activatable cell-penetrating peptides，ACPP)，该系统由药物、CPP R9、MMP2/9底物肽段PLGLAG、多聚阴离子肽段(中和肽)构成(图1)。在进入肿瘤组织前，因为静电作用，带负电荷的中和肽与带正电荷的CPP形成发夹结构使CPP失活；而进入肿瘤组织后，高表达的MMP 2/9酶切掉PLGLAG肽段，释放中和肽，使载药CPP恢复穿膜活性。载药ACPP系统应用于肿瘤诊断和治疗的研究报道日益增多，如载紫杉醇(paclitaxel，PTX)ACPPs可显著增加PTX肿瘤靶向转运，并能进入肿瘤组织的中心区域，与PTX及载PTX CPP相比，该系统显著增强PTX的抗肿瘤活性[31-33]。

图1基于肿瘤微环境低pH设计的靶向载药CPP系统示意图

3.2基于肿瘤微环境低pH设计的靶向载药CPP系统肿瘤微环境中的pH值较正常组织偏低，呈弱酸性，该病理特征已被广泛用于设计药物靶向递送系统。如KALE等[34]利用肿瘤的弱酸性微环境设计了聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG) 和TAT 共同修饰的pH敏感型载DNA脂质体，通过一条短的PEG链(相对分子质量1 000)将TAT修饰在脂质体表面，同时将长链PEG (相对分子质量2 000)通过pH敏感的腙键连接在脂质体表面形成隐蔽CPP的外壳(图1)，从而使CPP暂时失去跨膜转运的功能。在pH 7.4 条件下腙键稳定，PEG2000包裹着脂质体，使得CPP的功能被掩蔽。当该脂质体通过体循环到达肿瘤部位时，由于pH值降低，腙键断裂，长链PEG2000脱离脂质体，进而暴露出CPP并发挥跨膜转运作用；实验证明，pH 敏感脂质体所携载的DNA在肿瘤细胞中的转染效率是非pH敏感脂质体的3倍。

2012年，ZARO等[35]研究发现，与MMP 2/9响应相比，pH响应可更有效地使载药CPP恢复穿膜活性。pH响应的载药CPP系统由谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase，GST)、pH敏感的组氨酸-谷氨酸(histidine-glutamate，HE)重复寡肽、CPP MAP构成(GST-HE-MAP)(图2)。在正常组织pH环境下，组氨酸为电中性，谷氨酸的负电荷通过静电作用中和CPP的正电荷，CPP的穿膜作用减弱；反之，在肿瘤组织的弱酸性环境下，组氨酸质子化后由电中性变为带正电荷，从而中和了谷氨酸的负电荷，消除了谷氨酸与CPP的静电作用，CPP恢复穿膜活性。进一步研究发现，在pH6.5及以下环境，pH响应的载药CCP系统GST-(HE)10-MAP能被细胞有效摄取；反之，在pH7.0及以上环境中，GST进入细胞的效率显著降低；在人乳腺癌荷瘤小鼠模型中，该系统亦能被肿瘤细胞高效摄取，而非肿瘤细胞摄取GST的量显著减少[36]。YEH等[37]基于pH响应载药CPP系统制备了HBHAc(CPP)-(HE)15-精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase，ADI)，研究证实，在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人前列腺癌细胞系PC3的体外实验中，弱酸性环境下细胞摄取HBHAc-HE-ADI显著增加，且其抗肿瘤活性也显著增强。

此外，TANG等[38]将此设计用于纳米颗粒，将由寡聚精氨酸R6和pH敏感的组氨酸-谷氨酸重复寡肽组成的靶向序列偶联于包封了PTX的PEG- 聚乳酸聚合物胶束的表面，实现了PTX的特异性和靶向递送。

图2基于肿瘤微环境低pH设计的靶向载药CPP系统示意图

3.3基于外界刺激设计的靶向载药CPP系统HANSEN等[39]提出以紫外线(ultraviolet，UV)作为外界刺激因素，构建了UV敏感的靶向载药CPP系统。其将一个烷基链通过UV可裂解的连接臂与已修饰了脂质体的TAT相接，在UV照射下，烷基链与TAT断裂，TAT恢复穿膜活性并介导脂质体进入靶细胞。也有研究者认为，UV穿透性不强，提出了以近红外线(near infrared，NIR)作为外界刺激因素，其在CPP的赖氨酸侧链偶联上有双光子敏感的硝基苯衍生物，而硝基苯衍生物结构中的羧基可以屏蔽CPP的正电荷，在NIR的辐射下硝基苯衍生物与CPP解离，从而使CPP恢复穿膜活性[40]。

关于CPP的靶向性问题，目前主要采用“刺激-响应”策略，而且大部分研究结果令人满意，但研究总体上还处于起步阶段，未来需要去发现生物毒性更低、敏感性更高的方法来提高CPP的靶向性。

4 总结与展望

CPP的发现极大丰富了药物载体的研究，其以穿膜效率高、细胞毒性低和可携带多种货物分子等特点得到了药学研究者的青睐。随着对CPP研究与应用的深入，研究者对限制CPP应用的问题提出了许多改进策略，但目前对CPP的研究整体上仍处于初级阶段，需要在穿膜机制等方面进行更深入的研究。此外，仍需研发穿膜效率更高、毒性更低的穿膜肽，探索敏感性更强的靶向策略，以期使由CPP作为载体的药物递送系统得到广泛的临床应用。