中分化肺腺癌及癌旁组织中差异蛋白质组学分析

李晓亮，杨志刚，马希涛，王朝杰

(1.河南省人民医院呼吸内科，河南 郑州 450000；2.河南省人民医院肿瘤内科，河南 郑州 450000)

肺腺癌是肺癌中最常见的类型，由于其早期症状不典型，绝大多数肺腺癌患者确诊时已为局部晚期或晚期[1-2]。肺腺癌的发病和预后与生活习惯、空气污染、遗传等因素有关，目前已从细胞、动物水平对肺癌的发生、发展进行了研究，但无论是细胞还是动物组织均无法反映人类的真实情况，若直接从人肺组织的蛋白水平研究肺癌，可以详细了解肺腺癌的发病过程。随着蛋白质组学技术的日益完善，一些肺癌标志物已经被发现。有研究发现，transgelin-2可能与肺癌发病相关[3]。肺癌的分化程度越低，预后越差，但有关能够反映肺癌分化程度的标志物的研究较少，因此，希望通过本研究能发现与肺癌分化程度有关的蛋白标志物。

双向凝胶电泳技术(two dimensional gel electrophoresis，2-DE)建立肺腺癌及癌旁正常组织的凝胶电泳图谱的重复性高，分辨率好；基质辅助激光电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)主要将凝胶电泳图谱中的差异蛋白点进行鉴定。因此，本研究应用中分化腺癌及癌旁正常组织为样本，通过对比2-DE建立的双向凝胶电泳图谱，筛选出差异蛋白点，应用MALDI-TOF-MS对差异蛋白点进行鉴定，寻找与肺腺癌发生和分化程度相关的蛋白质，以期为肺腺癌的诊治提供线索。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2017年1～12月河南省人民医院收治的中分化肺腺癌患者为研究对象，病例纳入标准：(1) 经病理检查确诊为中分化肺腺癌；(2)可耐受手术。共纳入中分化肺腺癌患者20例，男12例，女8例，年龄52～71(61.45±4.27)岁；组织分化程度为中分化；肿瘤分期：Ⅰb期1例，Ⅱa期4例，Ⅱb期7例，Ⅲa 期8例。本研究通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器尿素、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸二钠、三氯醋酸、胰蛋白酶(美国Sigma公司)。TGL-16c 离心机(德国Anke公司)，722可见光分光光度计(上海上天精密仪器有限公司)，Transference Decoloring Ts-8摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，HY-5水平摇床(金坛市荣华仪器制造有限公司)，IPGphorII等电聚焦仪、第二向电泳仪、Uamax扫描仪(美国Amersham公司)，Ultraflex MALDI-TOF质谱仪(美国BrukerDaltonics公司)。

1.3组织蛋白浓度测定收集20例患者的癌组织及癌旁正常组织，使其处于无菌环境中，经生理盐水多次冲洗后立即放入-80 ℃液氮中保存备用。收集的标本冰浴下剪碎并磨制成粉。每个样品精确取100 mg粉末，加入1 mL蛋白裂解液中，混合均匀，在冰浴条件下使用超声细胞破碎仪操作3～4次，每次持续约15 s。将处理后的样品于4 ℃下放置2 h，然后12 000 r·min-1离心5 min。静置5 min后，取少量上清液，采用Bradford法测上清液中蛋白质浓度，其余上清液放入液氮中保存。

1.4肺癌组织蛋白双向凝胶电泳操作步骤严格按照GORG等[4]的方法与IPGphor等电聚焦系统指南进行。取出冷冻的固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)胶条，置于常温环境下直至胶条恢复至常温。将含组织蛋白的上清液与水化液混合均匀后，将IPG胶条放入混合液水化40 min，取出IPG胶条放置聚焦盘中行等电聚焦电泳。然后将胶条在平衡液和含碘乙酰胺的平衡液中晃动震荡各15 min后进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳过程中注意电流大小的变换以样品浓缩成一条线为标志，以溴酚蓝前沿移动至凝胶底边为电泳结束标志。电泳结束后，将胶条放入考马斯亮蓝 R250染色液中染色2 h(染色液中考马斯亮蓝R-250占 10%，冰醋酸占10%，无水乙醇占5%，去离子水占75%，均为体积比)。最后在脱色液中对样品进行重复脱色，样品背景透明为脱色完成后得到双向电泳图谱。同一标本的总蛋白质均重复检测3次。

1.5双向电泳图谱分析采用UMAX imagescanner扫描仪分别扫描2种组织的双向电泳图谱，获取分辨率为300DPI的凝胶图像，然后对凝胶图像进行处理，建立2-DE平均凝胶图像，选取差异2倍以上的蛋白点。

1.6差异蛋白点的质谱分析将2种组织的双向电泳图中的差异蛋白点切下，于37 ℃下在100 μL超纯水中浸泡适当时间，然后将差异蛋白点放入100 μL脱色液中进行脱色，每个差异性蛋白点至少脱色3次，以凝胶变为无色透明为准。对凝胶进行真空干燥处理，使样品处在冰浴的状态下，向样品中加入10 μL胰蛋白酶。然后将样品置于37 ℃下孵育9 h，添加10 μL工作液，持续孵育9～16 h，以保留液浓缩为5～6 μL为准。将浓缩后的保留液通过质谱仪进行处理，最终获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)。

1.7差异蛋白的鉴定将获得的差异蛋白点的肽质量指纹图谱使用Mascpt软件在相关数据库进行查询，鉴定出差异蛋白。

2 结果

2.1人肺腺癌组织及癌旁正常组织2-DE图谱及差异蛋白分析肺腺癌组织和癌旁正常组织的平均蛋白点数分别为1 810±167、1 703±53。肺腺癌组织和癌旁正常组织中筛选出18个差异2倍以上的蛋白点，其中10个差异蛋白点在肺腺癌组织中表达上升。

A：肺腺癌组织双向凝胶电泳图谱；B：癌旁正常组织双向凝胶电泳图谱；箭头所示为差异蛋白点。

图1肺腺癌组织及癌旁正常组织中差异蛋白2-DE图谱

Fig.12-DEimageofdifferentialproteinsinlungadenocarcinomatissueandadjacentnormaltissues

2.2人肺腺癌组织和癌旁正常组织中差异蛋白点的肽质量指纹图谱分析及鉴定结果见表1。18个差异蛋白点中13个蛋白点鉴定成功。该13个差异蛋白中有10个在肺腺癌组织高表达，包括肿瘤翻译调控蛋白、磷酸丙糖异构酶1、14-3-3σ蛋白、乙醇脱氢酶、醛脱氢酶1、α-烯醇化酶、细胞角蛋白(cytokeratin,CK)8等，其中肿瘤翻译调控蛋白与14-3-3 σ蛋白的肽质量指纹图谱见图2、图3。

表1肺腺癌组织及癌旁正常组织中差异蛋白点鉴定结果

Tab.1Identificationresultsofdifferentialproteinsinlungadenocarcinomatissueandadjacentnormaltissues

蛋白点号蛋白名称等电点相对分子质量覆盖率Mascot得分表达水平215肿瘤翻译调控蛋白4.8419 69729%89↑222组织蛋白酶前体B5.8838 75228%74↑298磷酸丙糖异构酶16.4526 91054%209↑35414-3-3σ蛋白4.6827 87137%84↑359碳酸酐酶16.5928 90944%110↓363碳酸酐酶16.5928 90937%79↓574乙醇脱氢酶6.3236 89256%210↑804醛脱氢酶16.355 42727%117↑807醛脱氢酶16.355 42735%153↑2 038α-烯醇化酶7.0147 48130%95↑2 040α-烯醇化酶7.0147 48136%114↑2 042CK85.5253 52928%120↑2 043β球蛋白7.8616 10176%149↓

图2肿瘤翻译调控蛋白的PMF

Fig.2PMFoftranslationally-controlledtumorprotein

图314-3-3σ的PMF

Fig.3PMFof14-3-3σprotein

3 讨论

蛋白质作为基因的最终产物，直接参与各种功能的执行。肿瘤发生的不同阶段蛋白质表达不同，而蛋白质组学可以筛检不同组织或疾病不同发展阶段的蛋白表达差异，因此，有可能为肿瘤的早期诊断、预后判断、治疗靶点提供较为可靠的依据。

2-DE是蛋白质组学研究的重要手段之一。可在相同条件下根据不同蛋白的等电点和分子量的不同，分离数千种蛋白，适合分离肿瘤和正常组织的蛋白，进而准确分析肿瘤相关蛋白。本研究通过双向凝胶电泳技术结合基质辅助激光电离飞行时间质谱鉴定出13个差异蛋白，包括各种参与生命过程的酶及前体、细胞本身的结构蛋白、肿瘤抑制因子及相关蛋白，如α-烯醇化酶、细胞角蛋白、肿瘤翻译调控蛋白等。

α-烯醇化酶作为一种多功能蛋白，除了在糖酵解的过程中起关键作用，在肿瘤的形成和发展过程中也起到了极其重要的作用。由于不同部位的α-烯醇化酶生物学功能不同，因此，分布在细胞不同部位的α-烯醇化酶对肿瘤的发生、发展起到的作用也不相同。位于细胞膜的α-烯醇化酶，其C端包含由16个氨基酸构成的可以锚定细胞膜的跨膜结构域。在肿瘤细胞侵袭及转移等过程中纤溶酶原系统发挥重要的作用，而细胞中α-烯醇化酶与纤维蛋白溶酶原结合可促进其活化，活化的纤维蛋白溶酶原可激活纤溶酶原系统，进而通过参与细胞外基质和基底膜重塑为肿瘤的发生、转移提供间接帮助[5-6]。α-烯醇化酶还可以促进癌细胞的糖酵解过程，从而加速癌细胞的能量代谢，为肿瘤细胞的生长提供充足的能量。有研究发现，位于细胞质中的α-烯醇化酶可促进肿瘤细胞进展和转移[7]。此外，有研究发现，α-烯醇化酶在非小细胞肺癌中通过加快细胞生长周期、促进糖酵解及上皮-间质转换相关基因的表达，促进癌细胞扩散及远处转移[8]。本研究发现，肺腺癌组织中α-烯醇化酶的表达显著高于癌旁正常组织。因此，α-烯醇化酶极有可能是通过加强糖酵解、激活纤溶酶原系统等途径促进肺癌发生、发展、侵袭、转移等。

CK是人体细胞重要的骨架蛋白之一，在人体内主要位于上皮细胞。根据分子量的不同和等电点的差异，主要分为酸性CK(CK9～CK19)和中性CK(CK1～CK8)。但在间叶组织中CK基本不存在，因此，可根据CK来判断恶性肿瘤的来源，并以此对肿瘤进行分类，这对了解细胞恶性转化、癌症发生的过程具有重要意义[9-10]。CK8主要在非鳞状上皮细胞中表达，如移行上皮细胞、气管上皮、小肠、胃及结肠等，在单层和假复层上皮细胞中则主要表达CK18。以往的研究表明，通过CK8/18对肺腺癌进行前期的诊断，其准确度可达71.7%，敏感度可达100.0%，特异度为16.7%[11]。有研究发现，血清CK8 水平的增加与非小细胞肺癌进展显著相关[12]。因此，CK8在癌症领域的多个方面均发挥着重要的作用。

肿瘤翻译调控蛋白是参与细胞增殖、分化与凋亡的主要因子，还参与细胞骨架重排等，与肿瘤细胞的生长、转移有着重要关系。p53是重要的肿瘤抑制因子和促凋亡基因。肿瘤翻译调控蛋白在重组人果糖-1，6-二磷酸酶的控制下，可进一步加强p53的泛素化降解，进而抑制癌细胞凋亡[13]。还有研究发现，肿瘤翻译调控蛋白可以增强肿瘤细胞对化学治疗药物的耐药性，提示其可能是应对肿瘤耐药的一个潜在靶点[14]。LIU 等[15]探讨了双氢青蒿素对A549肺癌细胞中肿瘤翻译调控蛋白表达的影响，结果发现，减少肿瘤翻译调控蛋白在A549细胞中的表达，可有效抑制A549细胞的生长增殖。因此，肿瘤翻译调控蛋白有可能是非小细胞肺癌的潜在治疗靶点。

以上这些蛋白有可能与肺腺癌的恶性程度、转移及预后相关，并且有可能成为诊断肺癌的标志物，但本研究样本量有限，如果扩大样本量，并将蛋白质组学与临床结合起来，将有助于肺腺癌的诊断和治疗。