塞来昔布联合培美曲塞对人肺腺癌A549 细胞株增殖、凋亡及PI3K/AKT 信号通路相关蛋白的影响

2019-04-25 08:03叶玉兰刘单邓述恺
中国现代医学杂志 2019年7期
关键词:抑制率细胞周期实验组

叶玉兰,刘单,邓述恺

(西南医科大学附属医院 呼吸与危重症医学一科,四川 泸州 646000)

选择环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂塞来昔布(Celecoxib,Cele)具有抗炎、解热、镇痛作用。近年来大量研究发现,Cele 对包括肺癌[1]在内的多种恶性肿瘤均表现出抗癌活性[2-3],但具体机制尚未完全明确。培美曲塞(Pemetrexed,Pem)是一种多靶点的抗叶酸化疗药物,被推荐用于非鳞非小细胞肺癌的一线治疗[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol -3-kinase,PI3K)家族是一类重要激酶,而蛋白激酶B(protein kinase,B)是PI3K 信号通路的核心靶点。 PI3K/AKT 通路广泛存在真核细胞中,与细胞生长、增殖、分化调节密切相关[5]。本实验拟通过Cele、Pem单药和联合用药与人肺腺癌A549 细胞共培养,研究Cele 与Pem 联合对肺癌细胞的增殖、凋亡的影响,并初步探讨其可能的作用机制,以期为临床肺癌化疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料

A549 细胞株(西南医科大学中心实验室),Cele(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),Pem(美国Selleck 生物科技有限公司),CCK-8 检测试剂盒、细胞凋亡及周期检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),HyClone 改良型RPMI 1640 培养基(北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司),BCA 蛋白质浓度测定试剂盒(武汉阿斯本生物技术有限公司),兔抗人AKT 一抗及p-AKT 一抗(美国CST 公司),内参GAPDH 抗体(英国Abcam 公司),山羊抗兔二抗(南非Aspen 公司),流式细胞仪(美国BD 公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞复苏、培养及传代 将A549 细胞株培养于RPMI 1640 培养基(含10%胎牛血清)中,置于5%二氧化碳CO2、37℃、恒温培养箱内,贴壁生长至85%时用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 CCK-8 法检测不同浓度下细胞组增殖抑制率和光密度(OD)值 将A549 细胞接种于96 孔板,温育24 h,加入Cele(0、5、10、20、40 及80 μmol/L)、Pem(0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 及8.0 μmol/L)后继续培养48 h,CCK-8 法检测OD 值,并计算半抑制浓度(IC50)用于后续实验的药物浓度。

1.2.3 CCK-8 法检测各实验组细胞增殖抑制率 将A549 细胞接种于96 孔板,分为对照组(加入培养液)和实验组,实验组又分为Cele 组(加入IC50浓度的Cele)、Pem 组(加入IC50浓度的Pem)、Cele+Pem组(加入IC50浓度的Cele 和Pem),每组设5 个复孔。37℃5% CO2培养箱中分别培养24、36 和48 h 取出,加入CCK-8 试剂,孵育4 h。酶标仪测量450 nm 波长处的OD 值,计算增殖抑制率。结合前期预实验,48 h增殖抑制效果最佳,择其作为后续药物实验干预时间。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 将A549 细胞接种于6 孔板,分组同1.2.3 部分,室温孵育48 h,收集细胞;加入300 μl Binding Buffer 悬浮细胞;加入5 μl Annexin V-FITC,混匀,避光孵育10 min,再加入5 μl PI,混匀,避光孵育5 min,上机检测。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期分布 将A549 细胞接种于6 孔板,分组同1.2.3,室温孵育48 h,收集细胞,PBS 洗3 次,加入预冷的70%乙醇,4℃固定过夜。收集细胞,PBS 洗涤3 次,加入500 μl RNase/PI 重悬细胞,避光染色20 min,上机检测。

1.2.6 Western blotting 检测AKT、p-AKT 蛋白水平 将A549 细胞接种于96 孔培养板,分组同1.2.3,室温孵育48 h,裂解液裂解细胞后提取总蛋白。BCA 法检测蛋白浓度,制定标准曲线,计算各组蛋白浓度。凝胶电泳,转膜,5%脱脂牛奶封闭,AKT 及p-AKT 一抗4℃过夜,TBST 洗膜,加二抗,洗膜,ECL 发光剂显影,拍照。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用重复测量设计的方差分析,两组比较采用LSD-t检验,方差齐性检测采用Levene 法,P<0.05 为差异有统计学意义。金氏法评价两药联合的相互关系,计算公式:Q 值= EA+B/(EA+EB-EA×EB)。结果判读:若Q 值<1,两药之间相互拮抗;Q 值=1,两药之间作用相加;Q值>1,两药之间相互协同。所有实验过程均重复3 次。

2 结果

2.1 不同浓度Cele 和Pem 单药对A549 细胞增殖的抑制作用及IC50

浓度为5、10、20、40 及80 μmol/L Cele 干预组细胞增殖抑制率分别为(17.300±3.988)%、(39.504± 1.656)%、(47.236±1.895)%、(51.662±5.387)% 和(63.379±1.986)%,差异有统计学意义(F=133.341,P=0.000),随着药物浓度增加,各组细胞增殖抑制率逐渐上升,但低浓度Cele(5 μmol/L)抑制作用与对照组差异无统计学意义(P>0.05);浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 及8.0 μmol/L Pem 干预组细胞生长抑制率分别为(28.976±3.483)%、(46.072±1.249)%、(60.735± 2.892)%、(70.359±3.886)%和(79.545±2.531)%,差异有统计学意义(F=230.315,P=0.000),随着药物浓度增加,各组细胞增殖抑制率逐渐上升。实验得知Cele IC50值为30.51 μmol/L,Pem IC50值为1.33 μmol/L。 见图1。

2.2 Cele 联合Pem 对A549 细胞增殖的抑制作用

IC50浓度条件下,各实验组与对照组作用于A549细 胞24、36 和48 h 对A549 细 胞增殖 抑 制 作用比较,采用重复测量设计的方差分析,结果:①不同时间点的细胞增殖抑制率有差异(F=1107.544,P= 0.000);②两组细胞的增殖抑制率有差异(F=149.865,P=0.000);③两组的增殖抑制变化趋势有差异(F= 2291.635,P=0.000)。见表1。

2.3 金氏法评价Cele 联合Pem 对A549 细胞增殖抑制作用

Cele 联合Pem 与A549 共培养48h,Q 值为1.001,约等于1,说明Cele 与Pem 联合干预体外培养的A549细胞增殖。

图1 不同浓度Cele 和Pem 作用于A549 细胞 48 h 的增殖抑制率比较 (±s)

2.4 Cele 联合Pem 对A549 细胞凋亡的影响

作用于A549 细胞48 h 条件下,对照组、Cele 组、Pem 组及Cele+Pem 组细胞凋亡率分别为(2.900± 0.900)%、(10.190±1.778)%、(11.813±0.846)%和 (24.630±0.252)%,差异有统计学意义(F=208.388,P=0.000);各实验组细胞凋亡率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),均有所上升;Cele+Pem 组细胞凋亡率与Cele 组、Pem 组比较,差异有统计学意义(P<0.05),Cele+Pem 组细胞凋亡率增加;而Cele组细胞凋亡率与Pem 组比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。

2.5 各组A549 细胞周期分布情况

作用于A549 细胞48 h 条件下,对照组、Cele组、Pem 组及Cele+Pem 组G0/G1 分别为(52.487± 0.267)%、(65.393±0.368)%、(65.577±0.064)% 和(75.143±0.778)%,差异有统计学意义(F=1270.915,P=0.000);与对照组比较,各实验组G0/G1 细胞比例均增加,差异有统计学意义(P<0.05);Cele+Pem 组细胞G0/G1 细胞比例与Cele 组、Pem 组比较,差异有统计学意义(P<0.05),Cele+Pem 组增加;而Cele 组G0/G1细胞比例与Pem组比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。见图2。

2.6 Cele+Pem 对A549 细胞AKT、p-AKT 蛋白表达的影响

作用于A549 细胞48 h 条件下,对照组、Cele组、Pem 组及Cele+Pem 组p-AKT/GAPDH 值分别为(0.544±0.033)、(0.267±0.042)、(0.157±0.014)和(0.063±0.021),4 组比较,差异有统计学意义(F= 148.409,P=0.000);对照组、Cele 组、Pem 组 及Cele+Pem 组AKT/GAPDH 值分别为(0.684±0.054)、(0.656±0.025)、(0.673±0.021)和(0.648±0.011),4 组比较,差异无统计学意义(F=0.748,P=0.553);与对照组比较,p-AKT/GAPDH 值在Cele 组、Pem 组及Cele+Pem 组均下调(P<0.05),且Pem 组p-AKT/GAPDH 值低于Cele 组(P<0.05),Cele+Pem 组p-AKT/GAPDH 值与Cele 组和Pem 组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3~5。

表1 Cele、Pem 单药和联合用药不同时间条件下对A549 细胞增殖的影响 (±s)

表1 Cele、Pem 单药和联合用药不同时间条件下对A549 细胞增殖的影响 (±s)

注:1)与对照组比较,P <0.05;2)与Pem 组比较,P <0.05;3)与Pem 组比较,P <0.05;4)与Cele 组比较,P <0.05;5)与24 h 比较,P <0.05

组别24 h 36 h 48 h OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/%对照组 0.994±0.013 - 1.038±0.039 - 1.158±0.047 -Cele 组 0.816±0.004 18.311±0.4311)2) 0.701±0.010 32.314±1.0111)2)5) 0.581±0.048 49.743±4.1861)5)Pem 组 0.805±0.007 19.510±0.6781) 0.665±0.015 35.513±1.4741)5) 0.588±0.023 49.192±1.7781)5)Cele+Pem 组 0.724±0.005 26.755±0.5541)3)4) 0.443±0.018 57.098±1.7851)3)4)5) 0.320±0.037 72.370±3.2321)3)4)5)

图2 各组A549 细胞周期分布情况

图3 A549 细胞中p-AKT 及AKT 蛋白的表达

图4 A549 细胞中p-AKT 蛋白的表达 (±s)

图5 A549 细胞中AKT 蛋白的表达 (±s)

3 讨论

选择COX-2 抑制剂Cele,具有抗炎、解热、镇痛作用,近年来大量研究发现,Cele 对包括肺癌在内的多种恶性肿瘤均表现出抗癌活性[1-3],其可能的机制为:阻断细胞周期进展,抑制细胞增殖及血管生成,诱导细胞凋亡[6-7];抑制癌细胞浸润及转移[8-9]相关。KIM 等[10]研究发现,Cele 能够触发内质网应激,诱导人非小细胞肺癌细胞系A549 和H460 细胞凋亡。ZHANG 等[11]分别用Cele 和XIAP-shRNA 单独或联合作用于A549 细胞,发现各实验组增殖率均表现出下降,细胞凋亡上升。CAI 等[12]报道,当Cele 作用于体外孵育的A549,G0/G1 期细胞群由41.2%增至60.5%,从而认为Cele 能够诱导G0/G1 期停滞,影响细胞周期进展,在H1299 细胞株中也得到相似结果。与该结果类似,本实验结果表明,较高浓度Cele(10、20、40 及80 μmol/L)可抑制A549 细胞的增殖和活力,但低浓度Cele(5 μmol/L)抑制作用与对照组比较,差异无统计学意义。另外与对照组比较,Cele 能够增加A549 细胞G0/G1 期比例。

某项荟萃分析报道[13],Cele 联合化疗可以显著改善晚期NSCLC 治疗的总体有效率。本实验通过使用Cele、Pem 单药和联合作用于体外培养的A549细胞,结果显示,与对照组比较,Cele、Pem 均呈浓度依赖性抑制A549 细胞增殖,且在IC50浓度条件下,Cele、Pem 呈一定时间依赖性抑制A549 细胞增殖,Cele+Pem 组抑制作用最强;各实验组A549细胞凋亡率及G0/G1 期细胞比例均有不同程度升高。WU 等[14]分析Pem 与作用于A549 细胞24 及48 h 后细胞周期分布情况,发现其呈剂量及时间依赖性诱导G1 期阻滞,另有学者报道[15],将PC9 细胞同时暴露于Pem 和吉非替尼将导致明显G1 阻滞,本实验结果与之类似。金氏法显示Cele 联合Pem 作用于A549 48 h,Q 值为1.001,说明两者联合对A549 细胞增殖抑制起到相加作用,Cele 能增强Pem 抗肿瘤效应。

真核细胞中广泛存在PI3K/AKT 信号通路,原癌蛋白AKT 被认为是PI3K 下游中心效应分子,参与细胞生长、增殖、分化的调节。PI3K 能够通过AKT 将细胞分裂信号向下游传递,调控细胞周期蛋白D 表达,通过周期蛋白D1-CDK4-Rb 调控细胞周期,从而影响细胞增殖[16-18]。此外,p-AKT 能使Bcl-2(抗凋亡蛋白)从聚合体中释放出来,从而发挥抗凋亡作用。据报道,Cele 可抑制前列腺癌PC-3 细胞株中p-AKT 的表达,从而诱导细胞凋亡[19];在非小细胞肺癌中,研究者发现放疗可以促进A549 细胞中p-AKT 的表达,而与各对照组相比,厄洛替尼+Cele 联合放疗组p-AKT 表达水平最低,从而认为厄洛替尼联合Cele 可能通过抑制PI3K/AKT 信号通路增强放疗的抗肿瘤效果[20]。以上研究提示AKT 可能是Cele 的作用靶点之一。本实验结果还发现,与对照组比较,Cele+Pem 组p-AKT 蛋白表达下降,而AKT 蛋白表达水平组间差异无统计学意义。表明AKT/p-AKT 至少部分参与了Cele 与Pem联合抗肿瘤的过程。

本研究表明,Cele 可增强Pem 抑制人肺腺癌A549细胞增殖、诱导细胞凋亡作用,其机制可能与诱导细胞周期G0/G1 期阻滞,抑制PI3K/AKT 通路相关蛋白AKT活性相关。其联合应用有望成为治疗NSCLC 的有效策略,但尚需进一步体内实验及相关临床试验进行验证。

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