盲肠结扎穿孔脓毒症大鼠肠黏膜通透性改变与TNF-α表达水平的关系*

许雄，陈建新，陈瑞媛，徐刚，石燕青，张森

广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科 广西南宁 530021

脓毒症是由感染引起宿主反应失调的全身性炎症反应综合征，在全球范围内伴有高发病率及死亡率，易导致多器官损伤和功能障碍，应引起足够的重视［1］。有观点认为，在多器官功能障碍中，肠道是炎症反应的启动器官，同时也是最易受损的器官之一，损伤后其防御性屏障功能减弱，肠黏膜通透性增加，可引发肠道内细菌和内毒素易位，导致促炎性介质和抑炎性介质平衡失调，造成恶性循环，进一步加重组织器官的损害［2］。

二胺氧化酶（diamineoxidase，DAO）是一种有较高活性的细胞内酶，主要存在于人类和哺乳动物的小肠黏膜和纤毛上皮细胞中，其活性与绒毛高度及黏膜细胞核酸蛋白合成密切相关，其中空、回肠部的活性最高［3］。有研究表明，肠黏膜细胞受损、坏死可引起肠黏膜二胺氧化酶表达水平的降低和血清二胺氧化酶表达水平的增高［4-5］，该酶释放入血的主要途径是透过肠黏膜屏障，因此测定血中二胺氧化酶的水平可一定程度反映肠黏膜通透性的变化情况，而脓毒症过程中肠黏膜受损引起肠黏膜通透性改变的相关机制目前尚不完全清楚。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作为最重要的早期促炎因子之一，在机体炎症的发生发展中起着较为关键的作用，可能在该过程中扮演了重要角色［6］。故本研究通过盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）方法制作腹腔感染脓毒症模型，并观察脓毒症大鼠初期血清二胺氧化酶（DAO）、血清TNF-α表达水平及回肠黏膜组织病理的情况，以探讨脓毒症大鼠早期肠黏膜通透性改变与血清TNF-α水平的可能关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取48只健康雄性SD大鼠为研究对象，大鼠7～9周龄、体质量（270.00±30.00）g，为清洁级（specified pathogen free，SPF），购自广西医科大学动物实验中心。所有大鼠实验前均在广西医科大学动物中心SPF级饲养房适应性饲养1 w（室温控制在25℃左右，空气湿度控制在50%左右，每日光照12 h，大鼠皆自由饮食饮水）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及造模 将48只SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组（n=24）与CLP组（n=24）。根据术后取材的时间点（分别为术后6 h、12 h、24 h、48 h），进一步将假手术组和CLP手术组两组随机各分为术后6 h组、术后12 h组、术后24 h组、术后48 h组四个亚组（每个时间点各6只），共计8个亚组。本研究参照课题组前期盲肠结扎穿孔术操作经验，制作腹腔感染脓毒症模型［7］。假手术组和CLP模型组均在CLP术前12 h禁食、6 h前禁饮。造模的具体步骤如下：按大鼠体重以0.60 mL/100 g的5%水合氯醛溶液进行腹腔注射，待大鼠瘫软后检查麻醉效果，用镊子钳夹下肢皮肤，当四肢无反应、呼吸浅慢有节律时即可认为麻醉成功。麻醉后，模型组以腹正中行1.5 cm纵形切口，逐层进入腹腔，找到盲肠，小心分离盲肠系膜，注意避免损伤回盲肠血管及接触腹部皮肤和毛发，将盲肠内容物轻轻挤向盲肠游离末端，在盲肠中段部位处用4-0丝线结扎，在已结扎盲肠与盲肠末端中间部位用21G针头贯通穿刺，移去针头后适当挤压少量肠内容物从两侧针孔溢出，小心将盲肠还纳至腹腔内，注意肠管不要接触到皮肤切口，并分层缝合腹壁切口；假手术组仅行剖腹手术，稍翻动肠管后立即关腹。术毕按大鼠体重3 mL/100 g予以皮下注射提前已预热至37℃的生理盐水，并由电烤灯供暖直至大鼠苏醒。苏醒后的各组大鼠送入动物房常规饲养。

1.2.2 大鼠造模后一般状况观察 分别观察假手术组和CLP组两组中各亚组大鼠的外观、活跃度、饮食状况等，并及时记录各组大鼠存活情况。

1.2.3 血液标本的采集及检测 在各组大鼠对应的取材时间节点上，使用与造模时相同的麻醉方法将大鼠麻醉，沿原手术切口打开腹腔，无菌纱布小心拨开肠管及腹膜组织，暴露腹主动脉，用一次性采血针在腹主动脉处穿刺取血3～5 mL，推入EDTA抗凝的试管中，室温下离心分离血清，分装于EP管中并标记，-70℃低温冰箱保存待检。使用ELISA试剂盒（购自武汉华美生物公司）检测假手术组和模型组大鼠不同时间点血清TNF-α、二胺氧化酶水平。

1.2.4 回肠黏膜组织学观察 每只大鼠在采血完成后立即距回盲部10 cm左右处取一段长2～3 cm的回肠组织，采用10%甲醛固定3 h，石蜡包埋，HE染色，病理显微镜下观察回肠黏膜形态。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件包进行分析。符合正态分布计量资料采用（xˉ±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用LSD-t检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况及腹腔炎症情况

本研究中各组SD大鼠在各取材时间点前未发现有死亡情况。假手术组大鼠活跃、饮食正常、被毛柔顺、无竖毛战栗情况，腹腔内小肠肠管无明显充血水肿等炎性表现（图1A）。造模组大鼠术后逐渐出现蜷缩在笼角、毛发竖立、浑身战栗、食欲减退等情况，腹腔内可见：造模6 h组可见小部分肠管扩张充气，充血渗出不明显；造模12 h组可见肠管水肿扩张明显，腹腔少量渗出液（图1B）；24 h组可见肠管充血水肿严重，内脏粘连严重及部分肠管发黑坏死，腹膜包裹呈局限状，表面脓性及血性渗出液较多（图1C）；48 h组可见肠管粘连进一步加重，腹腔血性渗出相对24 h组有所减轻（图1D）。

2.2 大鼠血清TNF-α水平

假手术组大鼠在术后6 h、12 h、24 h、48 h时血清TNF-α表达水平之间的差异无统计学意义（F=1.609，P=0.219）；CLP造模大鼠血清TNF-α表达水平在术后6 h时高于假手术组，后呈上升趋势，在术后12 h左右达到峰值，随后呈下降趋势，CLP组与假手术组在术后6 h、12 h、24 h、48 h四个时间点时血清TNF-α表达水平之间的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

2.3 大鼠血清DAO水平

假手术组大鼠术后6 h、12 h、24 h、48 h四个时间点的血清DAO表达水平之间的差异无统计学意义（F=0.467，P=0.709）；CLP组大鼠血清DAO含量随时间推移呈升高趋势，与假手术组在术后6 h、12 h、24 h、48 h四个时间点时表达水平之间的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

图1 大鼠腹腔炎症情况

表1 大鼠血清TNF-α表达水平（pg/mL，xˉ±s）

表2 大鼠血清DAO表达水平（U/mL，xˉ±s）

2.4 肠黏膜组织病理学改变

假手术组肠黏膜上皮完整，腺体排列整齐，无或仅有少量炎症细胞浸润（图2A），而CLP组大鼠回肠黏膜有较为明显的病理改变：术后12 h组开始出现肠黏膜和黏膜下层间质水肿及血管充血，黏膜层有部分中性粒细胞浸润（图2B）；24 h组肠绒毛明显排列紊乱，高矮不一，部分倒伏、融合，黏膜上皮糜烂缺失，部分固有层内腺体灶性区域坏死和隐窝脓肿形成（图2C）；48 h组仍可见黏膜水肿、充血及炎细胞浸润，但黏膜上皮脱落较24 h组减少（图2D）。

图2 大鼠回肠黏膜组织形态学观察（HE，×100）

3 讨论

肠黏膜屏障是指阻隔肠腔内致病菌、毒素等跨越肠黏膜至血液循环和外周重要组织脏器结构及功能的总和，主要由机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障四部分构成，是机体屏障系统的重要组成部分［8］。其中，由肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成的机械屏障是关键的结构基础［9］。当肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等结构破坏时，肠黏膜的通透性会显著增加，除致病菌、毒素等物质外，肠腔内容物及肠黏膜分泌的黏液和蛋白等亦能跨越肠屏障进入血液和组织［10］。

本研究中，血清TNF-α水平在盲肠结扎穿孔术后6 h起即高于假手术组，此后短时间内迅速升高，在术后12 h左右达到峰值，随后呈下降趋势，在术后24 h时仍维持在高浓度水平，在术后48 h仍高于假术组。目前相关研究已表明在肠道局部炎症引起肠组织细胞损害的早期，肠道巨噬细胞和中性粒细胞可产生大量TNF-α，其一方面是IL-1、IL-6等其他因子的激动剂，另一方面可促使内皮细胞、中性粒细胞等相互之间的移行、黏附，致产生的炎症介质大量增加，形成瀑布连锁效应，加重肠组织细胞的损伤［11-12］。在炎症后期血清TNF-α的表达水平呈下降趋势可能与抑炎因子的释放增多引起免疫抑制有关［13］。有研究报道在大鼠腹腔注射脂多糖制造内毒素休克模型中应用TNF-α、IL-6等炎性因子拮抗剂可明显减轻肠黏膜损伤程度［14-15］，提示在脓毒症中血清TNF-α水平的高低与肠黏膜损伤有关。

哺乳纲生物约95%的DAO存在小肠肠黏膜，另一部分约5%存在胎膜和肾脏组织器官［16］。相关文献也已报道DAO表达水平与肠道黏膜上层和固有层细胞内的脱氧核糖核酸合成、核糖核酸合成和氨基酸脱水缩合呈现紧密关联性［17］。因此认为，血清中DAO表达水平的高低可作为本研究中肠黏膜损伤程度及通透性改变的一个参考指标。本研究结果提示，相比于假手术组，CLP组术后6 h左右大鼠血清DAO表达水平即有升高，后随时间的推移而有升高趋势，至术后48 h时，其血清DAO表达水平均高于同时间点的假手术组。结合大鼠一般状态、腹腔内器官病变情况及回肠黏膜组织切片的病理学改变分析，提示在脓毒症病程中肠道黏膜损伤的持续加重可能导致肠黏膜通透性呈增加趋势，而肠黏膜和纤毛上皮细胞中的DAO透过破坏的肠黏膜屏障释放入血，引起血清DAO水平的升高。

综上所述，大鼠在盲肠结扎穿孔致脓毒症状态下可出现血清早期促炎因子TNF-α表达水平的升高，同时伴有血清DAO的变化及回肠肠黏膜病理改变，可以初步推断盲肠结扎穿孔脓毒症中TNF-α等促炎因子释放引发的炎症反应可能与肠黏膜通透性改变有关，但具体机制有待进一步的探索。