抗核抗体、抗核抗体谱及其联合检测诊断自身免疫性疾病的价值比较

郭佳佳，蒋晓钦，李 琰，慕珂珂，董炎红

自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）是机体对自身抗原产生免疫反应，造成自身组织损害而引发的疾病，其病因与自身抗原改变、免疫调节异常、遗传等相关［1，2］，主要表现为器官特异性自身免疫疾病和系统性自身免疫疾病，如甲状腺功能亢进、系统性红斑狼疮等，对患者身体健康具有不同程度的影响。自身抗体是AID诊断关键，分子生物学技术的不断进步使得AID有关抗体也不断被发现，AID检出率亦明显提高。抗核抗体（ANA）是指抗细胞核抗原成分的自身抗体，而以Hep-2细胞为基质的间接免疫荧光法（IIF）检测ANA是AID重要筛选实验［3］。此外，免疫印迹法（IBT）检测抗核抗体谱（ANAs）亦对AID鉴别和病情评价具有重要价值［4］。为了解ANA、ANAs及其联合检测对AID的诊断价值，笔者将所在医院1095例疑似AID患者作为研究对象，进行血清ANA、ANAs检测，观察其诊断结果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年1月—2018年6月笔者所在医院1095例疑似AID患者为研究对象，其中男382例，女713例；年龄4~80岁，平均（41.76±16.92）岁。

1.2 方 法

1.2.1 仪器与试剂 日本奥林巴斯BX50荧光显微镜，德国欧蒙EURO Blot MasterII型全自动免疫印迹仪，日本佳能公司Lide100扫描仪，欧蒙（杭州）医学实验诊断有限公司提供的ANA检测试剂盒、免疫印迹试剂盒。

1.2.2 检测方法 采集所有受检者清晨空腹静脉血5 ml，静置30 min后以3000 r/min离心，分离血清，采用 IIF检测 ANA，ANA 滴度设定为 1：100、1：320、1：1000 和 1：3200， 在载片反应区将稀释的血清标本和固定有包被基质生物薄片的Hep-2细胞进行反应，常温下孵育30 min，清洗封片，操作步骤均严格按照说明书进行，由2位有丰富经验的检验师在荧光显微镜下进行读片，观察有无荧光，抗体滴度≥100为阳性。采用IBT检测ANAs，检测nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP-B、PCNA、dsDNA、AMA-M2、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白15种特异性抗体。于膜条上平行抗原，将1：101稀释的血清标本和膜条上靶抗原进行反应，常温下孵育，加入酶标记抗IgG抗体后再次温育，跟底物液呈颜色反应后进行清洗，风干后使用扫描仪扫描，以EUROLineScan软件评估检测结果，特异性抗体强度为“+”及以上判为阳性。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计数资料以（%）表示，比较用χ2检验；ANA、ANAs两种方法检测一致性采用Kappa检验分析，κ<0.4表示检测一致性弱，0.4<κ≤0.6表示检测一致性中等，0.6<κ≤0.8表示检测一致性高，κ>0.8表示检测一致性极高；以最终确诊AID为标准，评估ANA、ANAs及其联合检测对AID的诊断效能，取P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ANA及ANAs阳性标本检测结果 1095例受检者血清标本中，ANA检测阳性为511例，阳性率为46.67%（511/1095）；ANAs检测阳性为490例，阳性率为44.75%（490/1095）。两种方法检测结果符合率为75.80%，检测一致性κ=0.511，P<0.05。其中ANA（+）/ANAs（+）比率为 33.61%，ANA（-）/ANAs（+） 比率为11.14%，ANA （+）/ANAs （-） 比率为13.06%，ANA（-）/ANAs（-）比率为 42.19%。

2.2 ANA阳性标本荧光核型及ANAs检测结果在511份血清ANA阳性标本中，荧光核型以核颗粒型、核均质型、混合型为主；ANA（+）/ANAs（+）标本荧光核型中，着丝点型、核颗粒型、混合型阳性率较高。见表1。

表1 ANA阳性标本荧光核型及ANAs检测结果［例（%）］

2.3 不同荧光滴度ANA阳性率及ANAs阳性率不同荧光滴度ANA阳性率、ANAs阳性率均存在差异，随着荧光滴度的增高，ANA阳性降低 （χ2=186.643，P<0.05）， 其中，ANAs所占比例逐渐增高（χ2=48.079，P<0.05），见表 2。

2.4 ANAs阳性标本中不同特异性抗体类型ANA阳性和阴性情况 490份血清ANAs阳性标本中，特异性抗体类型以Ro-52、SS-A和nRNP/Sm为主，ANAs（+）/ANA（+）标本中 nRNP/Sm、SS-A 和 Ro-52阳性比例较高，ANAs（+）/ANA（-）标本中，Scl-70、PM-Scl、PCNA阳性比例较高。见表3。

表2 不同荧光滴度ANA阳性率及ANAs所占比例［例（%）］

表3 ANAs阳性标本中不同特异性抗体类型ANA阳性和阴性情况［例（%）］

2.5 ANA、ANAs及其联合检出率比较 最终诊断结果显示，1095例疑似AID者中有668例为AID，ANA 检出率为 76.50%（511/668），ANAs检出率为73.35%（490/668），ANA+ANAs 检 出 率 为 94.76%（633/668），ANA+ANAs 检 出 率 显 著 高 于 ANA、ANAs检出率，差异均有统计学意义（χ2=58.332，χ2=78.648，P<0.05）。

3 讨论

AID是以自身免疫耐受平衡失调引发自身免疫反应的一类疾病，其临床症状复杂多样，诊断时容易与感染性疾病或其他系统疾病混淆，导致误诊或漏诊，影响患者治疗［5，6］。 及早明确诊断是 AID 患者实施有效治疗的基础，对提高患生存质量具有重要意义。IIF是我国临床实验室检测ANA最早的方法，且得到广泛应用，IIF-ANA作为AID诊断的标准方法，具有敏感度和特异性高、操作简便、检测范围广等优点。然而，IIF是以Hep-2细胞为基质，其包被抗原存在分布不均匀情况，且部分含量较低，容易发生特定抗原流失等情况，造成部分特异性抗体漏检［7，8］。 此外，部分人群在无 AID 情况下，也可检测出低滴度 ANA，影响结果判断［9，10］。 IBT 检测ANAs也是临床诊断AID较为常用方法，其操作简便，特异性高，自动化程度高，检测结果判读容易，并且能够单次检测多种抗体，长期保存膜条结果，方便查看［11，12］。

该研究对1095例疑似AID者进行血清IIFANA和IBT-ANAs检测，显示ANA检测阳性率为46.67%，ANAs检测阳性率为44.75%，两种方法检测结果符合率为75.80%，检测一致性κ=0.511，为中等一致，表明IIF-ANA和IBT-ANAs检测存在吻合情况，但并非完全一致，不可互为替代。王红娟等［13］亦对IIF-ANA和 IBT-ANAs检测情况进行探讨，显示两种方法的检测结果一致性为中度（κ=0.503），与该研究结果较为接近。此外，不同荧光滴度ANA阳性率、ANAs阳性率均存在差异，随着荧光滴度的增高，ANA阳性降低，ANAs阳性率升高，提示ANA阳性率与荧光滴度存在相关性，且ANA阳性结果与ANAs阳性结果亦有出入，也说明了IIF-ANA和IBT-ANAs检测不能相互替代。马华瑜等［14］研究指出，ANA 阳性标本中，核颗粒型、核均质型是其主要核型，但其未分析ANA与ANAs检出核型的关系。该次研究检验ANA阳性标本荧光核型，发现核颗粒型、核均质型、混合型是其主要核型，与马华瑜等［14］研究结果相符。 而 ANA（+）/ANAs（+）标本中，显示着丝点型、核颗粒型、混合型阳性率较高，提示核颗粒型、混合型是ANA与ANAs检出主要核型，且两种方法对其他核型检出情况亦存在差异。另一方面，ANAs阳性标本特异性抗体类型以 Ro-52、SS-A 和 nRNP/Sm 为主，ANAs （+）/ANA（+）标本中nRNP/Sm、SS-A和Ro-52阳性比例较高，ANAs （+）/ANA （-） 标本中，Scl-70、PM-Scl、PCNA阳性比例较高，说明ANAs与ANA对特异性抗体类型检出有差异，进行联合检测可提高各类型特异性抗体阳性检出率，有利于AID分类诊断。陈向华等［15］分析ANA和ANAs检测AID情况，表示同时进行ANA和ANAs检测能够有效提高AID检测结果准确性。该研究对ANA、ANAs及其联合检出率进行比较，显示ANA检出率为76.50%，ANAs检出率为73.35%，分析漏诊原因，前者可能是IIFANA检测中Hep-2细胞基质的包被抗原分布不均匀或含量较低，而后者与IBT-ANAs检测特异性抗体数量有限相关。结果中ANA+ANAs检出率显著高于 ANA、ANAs检出率（P<0.05），说明 ANA 联合ANAs检测可提高AID检出率。

综上所述，尽管ANA、ANAs检测均能够检出AID，但漏检和假阳性发生可能性较大，而ANA联合ANAs检测可减少漏检情况发生，提高AID检出率，为临床诊断提供有效依据。