口腔黏膜拭子检测UGT1A1基因多态性并分析其与伊立替康药物不良反应的关系＊

贾晓艳，付汉东

伊立替康（CPT-11）是半合成水溶性喜树碱的衍生物，是DNA拓扑异构酶I抑制剂，多用于结直肠癌、小细胞肺癌的二线治疗，也可用于胃癌，非小细胞肺癌、胰腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤的治疗［1］。伊立替康在体内的代谢失活依赖于多种酶的作用，其中最重要的属尿苷二磷酸葡糖苷酸转移酶1A1（UGT1A1）。UGT1A1多态性与伊立替康相关的延迟性腹泻和中性粒细胞减少有密切关系。UGT1A1多态性多通过采集患者外周血标本进行检测，该研究以结直肠癌患者口腔黏膜和外周血为检测标本，分别检测二者中UGT1A1基因多态性，探究口腔黏膜拭子提取DNA检测UGT1A1基因多态性的可行性，并分析UGT1A1多态性与伊立替康不良反应之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2017年1月—2018年4月于孝感市中心医院治疗的110例经病理诊断明确，并使用含伊立替康的治疗方案的结直肠癌患者，分别取其口腔黏膜和外周血进行UGT1A1基因多态性检测。所有患者均知情同意。化疗患者全部符合以下标准：（1）所有病例均经病理学确诊为结直肠癌，并由影像学检查（CT/MRI或PET-CT等）诊断为复发或远处转移，既往不曾使用过含伊立替康的化疗方案，至少存在一个符合实体瘤疗效评价标准（RECIST 标准）的可测量病灶；（2）年龄 18～75岁；距末次化疗4周以上，ECOG评分为0～1分，预期生存时间≥3个月；（3）无造血功能障碍、无凝血功能异常、无肝肾功能异常；无消化道梗阻；无合并感染。排除标准：（1）合并严重的心血管系统疾病或其他合并症、肝肾功能不全、高血糖状态未控制者；（2）精神异常；（3）妊娠及哺乳期；（4）严重的免疫功能缺陷。

1.2 方 法

1.2.1 口腔黏膜UGT1A1基因多态性检测 患者取样前30 min未进食、饮水及吸烟等，将一次性口腔拭子伸进口腔，紧靠脸颊内侧来回刮拭30次以上，以同样的方法在另一侧脸颊内进行第二根拭子的采样。采样完毕后，将拭子装回采集管，折断拭子柄多余部分，立即盖上采集管。采用DP322口腔拭子基因组 DNA提取试剂盒（购自北京天根生化科技公司）提取口腔黏膜拭子中的DNA，并使用紫外分光光度计测定DNA的浓度及纯度。提取DNA产物进行 PCR扩增。引物序列： 顺义链：5’-AGTCACGTGACACAGTCAAACA-3’ ，反义链：5’-CTTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3’。PCR反应条件：94 ℃，5 min；30 次循环 （94 ℃，30 s；67.5 ℃，20 s；72℃，20 s）；72℃，10 min。 采用焦磷酸测序法进行口腔黏膜UGT1A1基因多态性检测。

1.2.2 外周血UGT1A1基因多态性检测 抽取患者外周静脉血2～3 ml，使用全血DNA抽提试剂盒（QIAmp DNA Blood Mini Kit） 提 取 血 液 中 的DNA，并使用紫外分光光度计测定DNA的浓度及纯度。提取DNA产物进行PCR扩增，采用焦磷酸测序法进行外周血UGT1A1基因多态性检测。

1.2.3 治疗方案 所有结直肠癌患者均使用含伊立替康的二线化疗方案，加用或不加用分子靶向治疗药物 （贝伐珠单抗或西妥昔单抗）。具体化疗方案：（1）FOLFIRI方案。 伊立替康 180 mg/m2，静脉滴注90 min，第 1天；亚叶酸钙 400 mg/m2，伊立替康后静脉滴注2 h，第1天；氟尿嘧啶400 mg/m2，静脉推注5 min，第 1天；氟尿嘧啶 2400 mg/m2，静脉持续泵入46~48 h；每两周为一个周期。（2）伊立替康联合雷替曲塞。伊立替康180 mg/m2，静脉滴注90 min，第 1天；雷替曲塞 3 mg/m2，静脉滴注 15 min，第 1天；每三周为一个周期。化疗过程中如患者出现3～4级不良反应，则停药，并给予对症治疗，下一周期将伊立替康减量25%。

1.2.4 药物毒性评价标准 患者化疗后不良反应根据美国国立癌症研究所提出的通用毒性标准（NCI-CTC）3.0版对药物的毒性作用进行评价和分级。

1.2.5 统计学分析 使用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料比较以及与不良反应的关系采用χ2检验或Fisher’s精确概率法。取P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 口腔黏膜拭子与外周血检测UGT1A1基因多态性分布情况 110例患者口腔黏膜拭子与相对应的外周血检测UGT1A1基因多态性完全一致。其中85例 （77.3%）UGT1A1＊28基因启动子的TA序列重复 6 次，为野生型 TA6/6（图 1），21 例（19.1%）为6次和7次重复序列，为杂合突变TA6/7（图2），4例 （3.6%）为7次重复序列，为纯合突变TA7/7。UGT1A1＊6第1外显子211位点基因型，包括野生型（G/G）（图 3）82 例（74.5%）、杂合突变（G/A）（图4）23 例（20.9%）、纯合突变（A/A）（图 5）5 例（4.5%）。

图1 UGT1A1＊28野生型（T A6/6）测序图

图2 UGT1A1＊28杂合突变（TA6/7）测序图

图3 UGT1A1＊6野生型（G/G）测序图

图4 UGT1A1＊6杂合突变（G/A）测序图

图5 UGT1A1＊6纯合突变（A/A）测序图

2.2 UGT1A1基因频率与Hardy Weinberg遗传平衡检验 入组的110例患者UGT1A1＊28与UGT1A1＊6等位基因频率进行遗传平衡吻合度检验表明，抽样样本符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性（P>0.05）。

2.3 UGT1A1基因多态性与伊立替康不良反应的关系 UGT1A1＊28基因突变型 （TA6/7、TA7/7）共25例，其中TA6/7基因型21例发生3～4级腹泻共7例（33.3%），3～4级粒细胞减少 7例（33.3%）；TA7/7基因型 4例发生 3～4级腹泻 1例（25.0%），3～4级粒细胞减少1例（25.0%）。UGT1A1＊6基因突变型（GA、AA）共28例，其中GA 基因型 23例发生 3～4级腹泻共 7例 （30.4%），3～4级粒细胞减少 8例（34.8%）；AA基因型 5例发生 3～4级腹泻 2例（40.0%），3～4级粒细胞减少 3例（60.0%）。UGT1A1＊28基因突变型明显增加3～4级腹泻及粒细胞减少的风险，UGT1A1＊6基因突变型增加3级以上腹泻，但与粒细胞减少无显著相关性。见表1。

表1 UGT1A1基因多态性与伊立替康不良反应的关系［例（%）］

3 讨论

伊立替康是常用的抗肿瘤药物之一，为细胞周期特异性细胞毒药物，在体内被羧酸酯酶代谢为SN-38，通过抑制DNA拓扑异构酶I，诱导DNA断裂损伤、阻断DNA复制，进而产生抗肿瘤作用［2］。伊立替康在体内失活代谢最重要的酶为尿苷二磷酸葡糖苷酸转移酶1A1（UGT1A1）。UGT1A1基因多态性可导致SN-38在体内不能及时灭活，肠道内蓄积增加，进而产生肠道黏膜损伤、迟发性腹泻及粒细胞减少等不良反应。UGT1A1基因多态性研究最多的为UGT1A1＊28和UGT1A1＊6。不同的基因型可影响UGT1A1表达水平及活性的差异，导致伊立替康使用过程中出现不良反应的程度及类型上的差异。UGT1A1＊28多态性与启动子的TATA序列重复次数相关，其中TA重复6次的野生型（TA6/6）最多见，其次为杂合突变型 （TA6/7）和纯合突变型（TA7/7）。TA重复次数越多，UGT1A1表达越少。UGT1A1＊28 基因型为突变型（TA6/7、TA7/7）的患者使用伊立替康后发生3～4级不良反应的风险较高。UGT1A1＊6基因多态性发生于UGT1A1第1外显子 211 位点，有野生型（G/G）、杂合突变（G/A）、纯合突变（A/A）三种基因型。研究结果显示，相比野生型（G/G），突变型（G/A、A/A）增加了患者发生 3～4级以上不良反应风险增加。但基因多态性主要对何种不良反应产生影响，不同研究显示的结果不同。Oki［3］及 Atasilp［4］的研究均显示 UGT1A1＊28 与UGT1A1＊6基因多态性可能导致外周血粒细胞减少。刘静等［5］的研究提示UGT1A1＊28和UGT1A1＊6突变型较野生型均增加了患者发生3级以上腹泻及粒细胞减少的风险。该研究显示，UGT1A1＊28基因突变型明显增加3～4级腹泻及粒细胞减少的风险，UGT1A1＊6基因突变型增加3级以上腹泻，但与粒细胞减少无显著相关性。各研究结果结论不同可能与样本量有关，但均提示UGT1A1基因多态性与伊立替康的严重不良反应相关。因此，在使用伊立替康之前应对UGT1A1基因多态性进行检测，如UGT1A1＊28或UGT1A1＊6基因为突变型，使用伊立替康时发生不良反应的风险较高，建议适当调整给药剂量或修改治疗方案。

口腔黏膜上皮细胞具有代谢旺盛、更新快的特点，易脱落到唾液中［6］。这样的细胞具有完整的人类基因组 DNA 序列。相关实验结果表明［7，8］，分别利用来自口腔黏膜拭子里的DNA与血液里的DNA进行基因多态性检测，二者测序结果完全一致。为避免口腔黏膜拭子取样过程中可能出现的细胞取样数量不足，本实验中采样时口腔内来回刮拭次数较多，且两根拭子同时采样，减少了实验过程中可能因样本中细胞数量不足而出现的误差。取样后立即盖上采集管，减少微生物进入采集管导致的污染。本研究对比口腔黏膜及外周血分别进行UGT1A1基因多态性检测，二者结果无差异，提示口腔黏膜提取DNA可取代外周血进行UGT1A1基因多态性检测。以口腔黏膜为标本进行基因检测，具有安全、无创、结果准确、可反复取样的优点，不增加患者痛苦，且取材及样本处理均相对简单，适合临床应用与推广。

该研究仍存在一些局限性，仅检测了与药物疗效相关基因的常见突变位点，但不能完全覆盖检测基因的所有位点。除UGT1A1＊28和UGT1A1＊6之外，有研究发现，UGT1A1＊93［9］、UGT1A1＊1［10］等基因多态性也与伊立替康不良反应有关。未来还需更多大样本的研究来明确UGT1A1基因多态性与伊立替康不良反应的关系。

综上所述，伊立替康的不良反应与UGT1A1基因多态性密切相关，使用之前进行该基因多态性检测有助于临床医师预测化疗不良反应的严重程度，制定个体化的治疗方案与给药剂量。UGT1A1基因多态性检测可使用口腔黏膜拭子与外周血标本，二者检测准确性相当。临床医师可根据情况选择合适的标本进行基因多态性检测。