下肢缺血型糖尿病溃疡大鼠模型的建立及评估＊

李文惠，柳国斌

全球目前约有 4.2亿糖尿病患者，预计到2040年，患病人数将达到 6.42亿［1］。糖尿病患者一生中发生溃疡者达15%～20%［2］。糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）因其难治愈、经济压力巨大、严重影响生活质量等特点，已成为临床上亟待解决的难点和热点。近20年来，有关DFU病理机制的研究方向逐渐向缺血性和神经缺血性溃疡转变，65%以上DFU患者有下肢缺血症状，约是1990年的两倍［3，4］。 与神经性溃疡相比，缺血性溃疡复发率高，截肢风险翻倍，预后更差，然而目前尚缺乏缺血型溃疡的基础研究。所以，多层次、多领域探索糖尿病足发生发展机制尤为重要。

糖尿病足溃疡动物模型是实施该领域基础研究的良好载体，目前有关糖尿病溃疡的模型很多，大多是在糖尿病模型基础上制造溃疡。随着疾病病理的变化，缺血型溃疡模型的研究显得尤为重要。该课题组在前期研究基础上，充分结合糖尿病足的病理变化、临床表现，建立了糖尿病缺血型下肢溃疡的实验动物模型，并进行了一系列观察研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物和材料 雄性SD大鼠40只，体重（180±10）g，由上海中医药大学实验动物中心提供，其许可证号为SYXK（沪）2014-008。按照随机数字表法随机分为5组，每组各8只，即，糖尿病缺血型溃疡模型组（DIU）、糖尿病溃疡模型组（DU）、非糖尿病缺血型溃疡模型组 （NIU）、非糖尿病溃疡模型组（NU）及正常对照组（N）。 链脲佐菌素（STZ）购自Sigma公司，硫酸钡、柠檬酸、枸橼酸钠购自国药集团，血糖仪购自罗氏公司，高脂饲料（基础饲料73%、蔗糖4%、猪油20%、奶粉2%、胆固醇1%）购自上海中医药大学实验动物中心，SQL-5Q烫伤仪购自上海欣软信息科技有限公司，激光多普勒血流仪来源于上海中医药大学穆拉德中心。

1.2 模型构建

1.2.1 糖尿病缺血型溃疡模型制备 大鼠高脂饲料喂养8周后，用1.5%STZ溶液（链脲佐菌素STZ+pH值为4.5的柠檬酸-枸橼酸钠缓冲液）按实验大鼠体重35 mg/kg的剂量腹腔注射。注射24 h后尾端采血随机血糖>16.7 mmol/L，稳定3 d后复测随机血糖仍>16.7 mmol/L，糖尿病模型制备成功。

糖尿病大鼠模型稳定2周后，以3%戊巴比妥钠按2 ml/kg腹腔注射麻醉，结扎离断股动脉及其主要分支，缝合前以青霉素溶液冲洗伤口。术毕利用激光多普勒血流仪检测下肢血流情况。

血管结扎实验24 h后，戊巴比妥钠麻醉大鼠后，使用SQL-5Q烫伤仪面积4 cm2模具烫伤缺血下肢皮肤，参数设定压力9.8 N，温度90℃，接触时间8 s。

1.2.2 其他模型制备 糖尿病溃疡模型组 （DU）除不结扎血管外，其他处理过程与DIU组一致；非糖尿病缺血型溃疡模型组（NIU）除不制备糖尿病模型外，其他处理过程与DIU组一致。

1.3 观察指标

1.3.1 模型相关指标 糖尿病造模过程中观察16只大鼠第1、7、14天的体重、血糖的变化；慢性溃疡造模后24 h组织病理学检查，取溃疡与正常皮肤交界处组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，光镜下检查；并通过超声多普勒血流仪直观显示下肢的血流灌注量变化。

1.3.2 创面宏观指标 实验动物慢性溃疡造模后24 h、第5天、第10天创面的肉眼描述及创面第5天、第10天及第15天愈合率变化。

通过计算机利用Image J医学图像分析软件，沿溃疡边缘使用描记笔画出其轮廓，计算像素面积；再用描记笔画出标尺上1 cm的线段，测出1 cm线段像素值，计算1 cm2的像素面积；溃疡表面轮廓的像素面积除以1 cm2的像素面积，即为溃疡创面表面积［5］。已愈合面积与初始溃疡面积百分比即溃疡创面愈合率。

溃疡创面愈合率（%）=（初始溃疡创面面积-观察时间点溃疡面积）/初始溃疡创面面积×100%

1.3.3 模型微观指标 溃疡组织造模后及第15天模型中终末糖基化产物（AGEs）、血管内皮生长因子（VEGF）、重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等相关细胞因子的含量变化。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0 for Windows软件进行统计。计量资料以（x±s）表示，计数资料用构成比表示，组内比较用单因素方差分析；方差不齐者先校正方差；不服从正态分布者，采用非参数检验。取P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 模型相关指标

2.1.1 模型稳定性指标 随机分组后，16只糖尿病模型组（DM组）大鼠造模后逐渐出现多饮、多尿、多食、消瘦、毛发枯燥无光泽、对刺激反应迟钝、活动减少等症状。余只非糖尿病模型组（N组）大鼠精神良好、活动灵活、反应灵敏、毛发光洁。观察时间以1周为一个观察截点，包括糖尿病造模后（记为M1）、造模1周（记为M7）、造模2周（记为M14）。其中，血糖仪显示血糖为“HI”时记为33.3 mmol/L。随着病程发展，非糖尿病大鼠体重逐渐增长，由M1时的（468.5±9.9）g 至 M14 的（493.72±4.6） g，血糖一直在6 mmol/L左右；而糖尿病模型大鼠体重逐渐减轻，由 M1 时的（367.52±8.5）g至 M14 的（357.72±5.2）g，血糖均＞16.7 mmol/L。糖尿病模型稳定，与正常组差异很大。各组大鼠体重、血糖比较见图1。

图1 各组大鼠血糖、体重变化

2.1.2 皮肤病理切片 大鼠皮肤烫伤后即刻可见皮肤苍白、增厚或水疱。24 h后，剪取烫伤交界区皮肤，并行病理切片，经HE染色，发现大鼠皮肤组织炎症细胞浸润，伴随毛囊、汗腺等皮肤附件破坏，烫伤为深度Ⅱ级，如图2所示。烫伤24 h后麻醉下使用剪刀沿烫伤分界线将皮肤清除即完成溃疡创面造模。

图2 大鼠皮肤病理切片

2.1.3 下肢血流灌注量 按照固定测定区域，以5图像/s的频率，测定1 min的血流灌注量。取血管结扎侧（患侧）与非结扎侧（对侧）平均血流灌注量（PU），结果显示患侧血流灌注量为（55.98±12.63）PU，对侧为（87.56±19.34）PU，具体如图 3 所示。

图3 大鼠下肢血流灌注量

2.2 创面宏观指标

2.2.1 创面肉眼描述 观察溃疡造模后24 h的创面形态，非糖尿病溃疡模型组（NU、NIU）创面颜色红活干燥，表面分泌物少，创面周围收缩较早，周边不规则；糖尿病非缺血型溃疡模型（DU）创面颜色偏暗，表面伴渗出物，形状规则，创缘稍高，皮肤收缩出现较迟；糖尿病缺血型溃疡模型组（DIU）创面颜色略淡于非缺血型模型组。造模第5天，普通溃疡模型组 （NU、NIU）大鼠创面肉眼可见创面继续收缩，表面干燥，伴新鲜肉芽生长。DU和DIU组创面颜色、渗出、面积也逐渐改善。

2.2.2 创面愈合率 比较创面愈合过程中第5天、第 10天及第 15天时 DIU、DU、NIU、NU四组模型溃疡愈合率，其中正常组未制造溃疡，故不列入比较。见表1。创面愈合过程三个等时间段内创面愈合速度为 V5～10＞V10～15＞V0～5， 非糖尿病溃疡组（NU、NIU）愈合速度高于糖尿病组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 创面愈合率（%）

2.3 模型微观指标 分别在造模后（D0）及创面愈合第15天（D15）采用眼眶采血方式取大鼠静脉血，离心机分离血清通过ELISA检测血清血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮细胞生长因子（EGF）和晚期糖基化终末产物（AGEs）的含量。见表2。

相比正常对照组（N），各溃疡组（DIU、DU、NIU、NU）表现为生长因子表达偏低，糖代谢产物偏高的趋势，差异具有统计学差异（P<0.05）；非糖尿病溃疡组 （NU、NIU）总体表达水平较糖尿病溃疡组（DU、DIU）细胞因子显著性偏高，AGEs显著性偏低 （P<0.05），且DU组较DIU组也表现为同样趋势；随着模型时间进程，各组的生长因子表现下降趋势，AGEs表现为上升趋势。

3 讨论

糖尿病足溃疡的发生机制与愈合条件尚不清楚，创建简易、可重复性高及成本低廉的实验动物模型，可以为明确发病机制、开发诊断预后标志物、筛选评价药物提供良好的载体。

3.1 糖尿病模型的建立 目前糖尿病基因敲除及转基因动物模型发展迅速，但因其价格高昂，高脂饲料联合链脲佐菌素（STZ）注射的方式受到大批量动物实验者的首选，因不同批次品种的实验动物耐受性的问题，高脂饲料喂养的时间及STZ注射剂量的选择仍存在较多争议。该课题组经过前期动物实验的摸索，通过对造模后大鼠饮水量、饮食量、血糖、体重的检测，总结出高脂饲料喂养8周、STZ 35 mg/kg腹腔注射的方式培养出的糖尿病动物模型更为稳定，因此该次实验中采取此种造模方式，造模中监测了血糖和体重，符合糖尿病体重逐渐减轻和随机血糖超过16.7 mmol/L的特点。

表2 模型生长因子及相关产物变化（μmol/L）

3.2 糖尿病溃疡模型的建立 糖尿病溃疡造模方式多采取直接剪除、压力性模型及烫伤模型［6］，直接剪除部分皮肤的急性创伤不符合慢性溃疡愈合的机制，压力因素造模方式的可控性不强，相比较而言，恒定烫伤条件下的深Ⅱ度烫伤具备操作简易、可控性强及可重复性高的优势；深Ⅱ度烫伤创面也属于慢性创面，更适宜研究糖尿病溃疡延迟愈合的机制。此次造模中经过前期不断摸索，最终参数设定为压力9.8 N，温度90℃，接触时间8 s，以便得到深Ⅱ度烫伤的创面，并通过检验烧伤深度的金标准-组织学检测［7，8］进行验证，发现皮肤组织中炎性细胞浸润，伴随毛囊、汗腺等附件破坏，符合深Ⅱ度烫伤。

3.3 下肢慢性缺血模型的建立 糖尿病下肢缺血属于慢性缺血，但慢性缺血的条件、方式尚无公认方式，目前肢体缺血模型仍以急性缺血为主。大鼠肢体血供丰富，存在大量吻合支［9］，后肢缺血模型建立中需要结扎股动脉及其分支，包括腹壁浅动脉、旋髂浅动脉及阴部外动脉，术后血流灌注量明显下降，激光多普勒（LDPI）是评估模型缺血状态的一种相对客观准确的方式［10］，能通过直观指标判断模型质量。该实验中结扎血管侧的血流灌注量明显低于对侧，表明缺血模型建立成功。

3.4 细胞因子与创面愈合 创面愈合是一个涉及多种细胞、细胞外基质及生长因子的复杂过程，其中纤维细胞组织、新生血管是肉芽组织重要组成部分。糖尿病足溃疡属于慢性溃疡，愈合周期超过3个月，处于一种缺乏炎症反应、修复细胞“失活”或“休眠”的状态。造模后观察了不同模型组血管及上皮化相关的细胞因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）、表皮细胞生长因子（EGF），以反应创伤愈合相关细胞的状态；另外晚期糖基化终末产物（AGEs）的积累能反应糖尿病过程的进展。VEGF能调节血管内皮增殖、迁移、加速新生血管形成［11］，愈合过程中VEGF表达下调直接影响慢性创面的愈合进程。PDGF能够刺激组织修复过程的多种细胞迁移和增殖，并促进细胞外基质成分的合成、分泌。创面肉芽组织产生及上皮化过程是创伤愈合的关键阶段，也需要大量bFGF、EGF的参与。代谢组学研究表明［12］糖尿病大鼠在溃疡组织愈合过程中的成纤维细胞增殖和毛细血管增生都明显弱于非糖尿病组，并直接影响溃疡愈合。研究表明，糖尿病大鼠创面VEGF的表达显著低于正常对照组大鼠，且表达明显滞后。由于缺血肢体内VEGF基因表达减少，引起糖尿病足闭塞血管周围侧支血管明显减少，侧支代偿不足，缺血性溃疡持续进展且难以愈合，这可能是引起糖尿病足溃疡的重要原因。该实验中也发现糖尿病模型中的血管、上皮化相关生长因子表达明显低于非糖尿病创面，差异有统计学意义，表现为修复细胞“失活”的状态，并且随着创面愈合进程的发展仍表现出生长因子不足的状态，符合糖尿病溃疡的变化规律。糖尿病模型中，缺血型较非缺血型表达水平明显下降，差异有统计学意义，表明缺血因素影响生长因子表达；糖尿病缺血型溃疡组织中促进血管生成的正向调节因子-血管生成抑制素结合蛋白降低，提示缺血环境影响血管生成［13］，而动脉结扎模型前3 d以缺血型损伤为主要特征，3～5 d 出现代偿［14］，创面周围的血流灌注不足，可能导致与缺血肢体内相关生长因子基因表达降低；此部分数据与其他研究数据存在一定分歧，今后会进一步探讨。糖尿病模型中AGEs的蓄积明显高于非糖尿病组，表示糖过量积累；具有细胞毒性的AGEs大量累积，会诱导血管损伤、组织功能紊乱，引起成纤维细胞的凋亡，导致生长因子的减少，阻碍内皮细胞增殖。

综上所述，该次实验摸索的糖尿病大鼠下肢缺血型溃疡模型，高脂饲料联合STZ注射符合2型糖尿病发病过程，深Ⅱ度烫伤模拟了糖尿病慢性溃疡难愈的过程，但结扎血管创造的后肢缺血模型不太符合慢性缺血的过程，希望能进一步摸索条件。总的来说，此次实验模型可重复性高，操作简单，值得临床进一步验证与推广。