黄连素抑制GRP78表达促进三阴乳腺癌细胞凋亡的研究

赵虹沃立科胡袁媛王安妮卢德赵

1.浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006 2.浙江中医药大学生命科学学院

乳腺癌的发病率逐年上升，目前已占据女性恶性肿瘤的首位，病死率仅次于肺癌[1]，其中三阴乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一类雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）以及人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptors-2，HER-2）均为阴性的乳腺癌，其发病率占乳腺癌总发病率的15%～25%。TNBC具有侵袭能力强、复发率高、总体预后差等临床特征[1-3]。由于TNBC的特殊生物学特性和病理特征，使得放疗、内分泌治疗或抗HER-2的生物靶向治疗均未能取得很好的效果[4-5]。因此，探索新的治疗靶点及开发相应的药物成为TNBC临床和基础研究的热点。

黄连素又名小檗碱，是从黄连、黄柏、三颗针等药用植物中提取出来的天然生物碱，具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血糖等多种药理活性[6]。近来研究发现，黄连素能够提高乳腺癌细胞的药物敏感性，抑制乳腺癌细胞的转移，并可促进乳腺癌细胞凋亡[7]。本实验拟以MDA-MB-231细胞为对象，研究黄连素对TNBC细胞增殖和凋亡的影响，并从葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）调控的角度探讨其分子机制，为黄连素的临床应用提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 细胞株 TNBC细胞株MDA-MB-231细胞由南京医科大学惠赠。

1.2 药物和试剂 黄连素购于天津一方科技有限公司（批号：AB271B），以二甲基亚砜溶解备用；DMEM培养基购于 Hyclone公司（批号：15112708）；GRP78、Bax、Bcl-2抗体均购于武汉三鹰生物技术有限公司（批号：11587-1-AP、50599-2-Ig、12789-1-AP）；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于美国BD公司（批号：3352555）；免疫球蛋白重链结合蛋白诱导剂X（immunoglobulin heavy chain binding protein inducer X，BiX） 购于 Atomax Chemicals公司（批号：101714-41-4）；MTT购于上海麦克林生化科技有限公司（批号：C10111913）。

1.3 主要仪器 3111型CO2培养箱购于美国Thermo Fisher Scientific公司；SpectraMax190酶标仪购于美国 Molecular Devices公司；Power PacTMHCBIORAD电泳仪为美国Bio-Rad公司产品；5427R高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品；Becton-Dickinson流式细胞仪购于美国BD FACS Calibur公司。

1.4 方法

1.4.1 MDA-MB-231细胞培养 MDA-MB-231细胞培养使用含10%胎牛血清、100mg·L-1青霉素和100mg·L-1链霉素的DMEM培养基。将细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，以0.25%胰酶消化传代。传代后3d处于对数生长期的细胞用于实验。

1.4.2 MTT检测MDA-MB-231细胞增殖活力 收集对数生长期细胞，经0.25%胰酶消化后接种于96孔板中，细胞密度为1×104/孔，每组设6个复孔。常规培养24h后弃去原有培养基，以200μL分别含终浓度为 0、20、40、60、80、100μmol·L-1黄连素的培养基处理细胞，24h后加入 5mg·mL-1MTT溶液20μL，继续孵育4h，弃去培养基，每孔加入二甲基亚砜150μL，以微量振荡器振荡10min使结晶物充分溶解，酶标仪于490nm波长处检测每孔的吸光度值。计算各组细胞存活率：细胞存活率（%）=AR/A0×100%，AR 为各组的吸光度值，A0 为对照组（黄连素浓度为 0μmol·L-1）细胞的吸光度值。

1.4.3 AnnexinⅤ/PI检测MDA-MB-231细胞凋亡情况 收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，以2×105/孔的细胞密度接种于6孔板中，常规培养24h后分组如下：（1）对照组：不加入黄连素；（2）黄连素组：分别加入 20、40、60μmol·L-1的黄连素；（3）Bix 组：加入 1μmol·L-1BiX；（4）BiX 联合 40μmol·L-1黄连素组：加入 1μmol·L-1BiX 联合 40μmol·L-1黄连素；（5）BiX 联合 60μmol·L-1黄连素组：加入 1μmol·L-1BiX联合60μmol·L-1黄连素。各组培养24h后弃去培养基，胰酶消化后，3000r/min离心5min收集细胞，加入RNA酶后37℃水浴1h，再置于冰浴冷却，按说明书要求加入适量的PI和AnnexinⅤ，流式细胞仪检测细胞凋亡情况[8]。

1.4.4 Western blot检测GRP78、Bax和Bcl-2的蛋白表达 取对数生长期细胞，以2×105/孔的细胞密度接种于6孔板中，常规培养24h后分组同1.4.3。培养24h后弃去培养基，以预冷PBS洗涤2次，离心收集细胞后加入适量裂解液冰上裂解40min，4℃下12 000r/min离心30min，将上清液转移至新离心管，BCA法检测蛋白浓度后，调整蛋白浓度，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转PVDF膜，脱脂奶粉封闭2h，分别加入一抗（1:1 000），4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗（1:8 000）孵育2h，洗膜，ESL化学显影、曝光，分析各条带光密度值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖活性比较 MTT结果提示，与对照组（黄连素浓度为0μmol·L-1）比较，黄连素浓度≥40μmol·L-1时，MDA-MB-231 细胞存活率明显下降（P＜0.01，P＜0.001）。见表 1。

2.2 各组细胞GRP78蛋白表达比较 与对照组比较，20μmol·L-1黄连素对 GRP78 表达无显著影响（P＞0.05），40、60μmol·L-1黄连素组 GRP78 表达显著下调（P＜0.01）；与 20μmol·L-1黄连素比较，40μmol·L-1黄连素组 GRP78 表达降低（P＜0.01）；与 40μmol·L-1黄连素比较，60μmol·L-1黄连素组 GRP78表达降低（P＜0.01）。见图1。说明黄连素对GRP78表达的影响具有一定的量效关系，因此后续研究中以40μmol·L-1和60μmol·L-1作为黄连素浓度，进一步检测黄连素对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。

表1 各组MDA-MB-231细胞存活率比较（%）Tab.1 Comparison of cell survival rate in each group(%)

图1 各组细胞GRP78蛋白表达比较Fig.1 Comparison of expression of GRP78 in each group

2.3 各组细胞凋亡情况比较 与对照组比较，40、60μmol·L-1黄连素组细胞凋亡率显著增加（P＜0.01），而BiX组细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），说明GRP78的激活可以抑制MDA-MB-231细胞凋亡，黄连素能促进MDA-MB-231细胞凋亡。与BiX组比较，BiX联合 40、60μmol·L-1黄连素组细胞凋亡率增加 （P＜0.01）。与 BiX 联合 40μmol·L-1黄连素组比较，BiX 联合60μmol·L-1黄连素组MDA-MB-231细胞凋亡率增加（P＜0.01），说明黄连素可以逆转BiX对细胞凋亡的抑制作用，促进MDA-MB-231细胞的凋亡。见图2。

2.4 各组细胞GRP78和凋亡相关蛋白表达比较与对照组比较，40μmol·L-1和 60μmol·L-1黄连素组中Bax蛋白表达均增高（P＜0.01），而GRP78和Bcl-2蛋白表达均减低（P＜0.01）；BiX组细胞中Bax表达减低（P＜0.05），而 GRP78和 Bcl-2表达增高（P＜0.01，P＜0.001）。与 BiX 组比较，BiX 联合 40μmol·L-1黄连素组和BiX联合60μmol·L-1黄连素组细胞中Bax表达均显著增加（P＜0.01），GRP78和Bcl-2的表达均降低（P＜0.01）。40μmol·L-1和 60μmol·L-1黄连素组比较，以上蛋白表达组间差异无统计学意义（P＞0.05）。Bix联合 40μmol·L-1黄连素组和 Bix 联合 60μmol·L-1黄连素组比较，以上蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图2 各组细胞凋亡情况比较Fig.2 Comparison of cell apoptosis in each group

图3 各组细胞GRP78和凋亡相关蛋白表达比较Fig.3 Comparison of expression of GRP78 and apoptosis related proteins in each group

3 讨论

乳腺癌是严重影响女性健康的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，是世界发病率排名第二的肿瘤性疾病。同其他大多数国家一样，目前乳腺癌已成为我国妇女最常见的癌症，而且其发病率正不断增高[1]。TNBC是一种具有高侵袭性、高复发性的乳腺癌病理亚型[9]，由于ER、PR和HER-2均呈阴性，TNBC缺乏明确的治疗靶点，临床上患者术后多使用含有蒽环类或紫杉醇类的药物辅助化疗。TNBC对致DNA损伤或抑制DNA损伤修复的药物敏感，但易产生耐药性，被认为是预后最差的乳腺癌亚型之一[10]。因此探索安全、不良反应小、效用性强的治疗药物和方案成为TNBC研究中亟待解决的问题。传统医学在肿瘤防治中发挥了重要作用，现代研究也表明许多中药复方和单味药均具有良好的抗肿瘤活性[11]，故从中药中筛选安全、有效、价格合适的药用成分用于肿瘤治疗和预防的研究成为热点。

既往临床研究中，黄连素主要用于治疗腹泻、痢疾、疟疾等胃肠道感染性疾病，近年来体内和体外研究表明，黄连素对乳腺癌、结肠癌、肺癌等都有抗肿瘤作用，其机制与抑制肿瘤细胞增殖，并能诱导肿瘤来源的细胞凋亡有关[12-14]。本研究发现，黄连素作用24h后，MDA-MB-231细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率增加。蛋白质是生物学功能的执行者，本实验应用免疫印迹技术检测了凋亡相关蛋白的表达，实验结果表明，40、60μmol·L-1黄连素处理 MDA-MB-231 细胞24h后，促凋亡基因Bax的蛋白表达上调，凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达下调，表明黄连素能调节凋亡相关基因的表达，诱导MDA-MB-231细胞凋亡。

GRP78是热休克蛋白家族的成员之一，又称免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip），是内质网应激特征性蛋白[15]，不仅参与肿瘤内质网应激反应，帮助未折叠蛋白折叠，还可参与细胞表面信号转导，调控细胞凋亡[16]。肿瘤组织生长过快，易发生缺血缺氧，导致内环境稳态失衡，从而促使内质网腔内的未折叠或错误折叠的蛋白积累，这种现象最终激活未折叠蛋白反应和内质网应激，诱导GRP78表达，促使过表达的GRP78与未折叠或错误折叠的蛋白疏水性残基端以及钙离子识别结合，减少内质网上的未折叠或错误折叠的蛋白积累，维持钙离子平衡，恢复内质网生理功能[17]。此外，GRP78还可与内质网应激激活的促凋亡受体结合，抑制其信号表达，从而保护细胞，维持机体内环境稳态[18]。研究表明，肿瘤发生发展过程中，往往伴有GRP78表达上调，抑制肿瘤细胞凋亡并促进肿瘤发生耐药、复发及转移。研究发现，随着乳腺癌临床分期的延后，GRP78表达不断增高[19]。研究已证实，在各种癌细胞系，以及实体瘤组织和活组织检查标本中GRP78表达升高[20-21]。研究发现，乳腺癌患者中GRP78的过表达与化疗耐药相关[22]。在乳腺癌细胞中，GRP78的表达在细胞凋亡通路调控中发挥关键作用[23]，提示GRP78不仅可以作为指示乳腺癌发生的一个指标，还可以作为乳腺癌治疗的一个靶点。现有研究表明，黄连素能够抑制乳腺癌细胞的转移，并可诱导乳腺癌细胞凋亡[7]。本研究提示，BiX诱导GRP78的过表达能够导致MDA-MB-231细胞凋亡率降低，促进Bcl-2表达，抑制Bax表达，说明GRP78表达与TNBC细胞凋亡有关。而与BiX组比较，BiX联合40、60μmol·L-1黄连素处理后，细胞凋亡率增加，细胞中GRP78表达受到抑制，Bax表达增加，Bcl-2的表达下调，说明了黄连素能够抑制GRP78的表达，从而逆转BiX对凋亡的调控作用，促进MDA-MB-231细胞的凋亡。

综上所述，黄连素可能通过下调MDA-MB-231细胞内GRP78的表达，增加促凋亡基因Bax的表达，并抑制凋亡抑制基因Bcl-2表达，从而促进MDAMB-231细胞凋亡。