乌骨藤C21甾体苷对唾液腺腺样囊性癌荷瘤小鼠的抑制作用及机制研究

徐加杰 葛明华 郑国湾 王林红 郭海魏 郑传铭

乌骨藤，又名通光散，具有消炎镇痛、止咳平喘、抗肿瘤的功效[1]。由乌骨藤提取物制备的消癌平已作为治疗消化道癌的一线药物广泛应用于临床。药理研究发现，乌骨藤中主要化学成分C21甾体苷对多种恶性肿瘤有明显的抑制作用，C21甾体苷广泛存在于萝藦科植物中，有诱导和促使微管蛋白聚合、微管装配与微管稳定的独特作用机制，从而彻底铲除肿瘤细胞有丝分裂的原生动力[2]。C21甾体苷能对肝癌荷瘤小鼠起到抑制肿瘤增长和提高荷瘤小鼠免疫保护的功能，还能诱导癌细胞G1期阻滞，上调促凋亡基因caspase-3、caspase-9和Bax的表达，下调抑凋亡基因Bcl-2的表达，从而诱导癌细胞的凋亡[3-4]。唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）为常见的唾液腺恶性肿瘤，约占全部唾液腺恶性肿瘤的21%～24%[5]。目前主要的治疗手段为手术治疗辅以放化疗的综合治疗策略，但SACC具有侵袭性强且易复发转移的生物学特点，经过治疗的SACC患者在短暂无病生存期后出现局部复发和远处转移较为多见，且一旦发生远处转移，SACC患者中位生存期仅为3年，为临床治疗带来极大的困难[6]。本实验通过建立SACC移植瘤模型裸鼠，探讨乌骨藤有效成分C21甾体苷对SACC的抗肿瘤作用及其在肿瘤增殖、凋亡过程中的分子机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 动物与瘤株 BALB/C裸鼠24只，4周龄，由上海斯莱克公司提供，动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0021。饲养条件：恒温，温度 22±2℃，湿度 50%～60%，光照每12h明暗交替，换风次数15～20次/h。由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养。实验饲养室许可证号：SYXK（浙）2013-0184。细胞株：涎腺腺样囊性癌的低侵袭细胞株（SACC-83）和肺高转移细胞株（SACC-LM）由中科院上海细胞库提供。

1.2 药品与试剂器材 乌骨藤C21甾体苷提取物由浙江中医药大学中药饮片厂中药炮制研究中心提供（批号20171229）；DMEM高糖培养基：Hyclone公司（批号AD17497268）；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司（批号18040504）；Trypsin 0.25%（1×）：Solution Hyclone公司（批号 J1800038015）；SYBR Green qPCR试剂盒：康为世纪（批号CW2601）；逆转录试剂盒：康为世纪（批号CW2569）；RIPA裂解液：碧云天（批号P0013D）；BCA蛋白定量试剂盒：Solarbio 公司（批号 pc0020）；Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9抗体：Affinity公司（批号 AF6139）。游标卡尺（上海SANTO公司）；Mastercycler PCR仪（Eppendorf公司）；核酸定量仪（Thermo Scientific公司）；实时荧光定量PCR仪（Bio-red公司）；CMaxPius酶标仪（SpectiaMax公司）。

2 实验方法

2.1 动物模型制备及分组给药 取24只裸鼠，收集对数生长期SACC-83及SACC-LM细胞，调整细胞浓度为1×107个/mL，每只裸鼠颈部右侧皮下接种0.2mL，继续饲养于SPF环境，2～3周后供实验用。待肿瘤增殖至可以触及时，将小鼠随机数字表法分为四组，每组6只。SACC-83模型组（生理盐水）高分化细胞；SACC-83 C21甾体苷组（C21甾体苷，10mg/kg）；SACC-LM模型组（生理盐水）低分化细胞；SACC-LM C21甾体苷组（C21甾体苷，10mg/kg）。每日腹腔注射 1次，连续注射4周，30天后取材。

2.2 抑瘤率及体征观察 待肿瘤长出后，测量生长肿瘤的瘤块长径（L）和横径（W），单位为毫米（mm）。肿瘤体积=（L×W2）/2，肿瘤增长率=[（B-A）/A]×100%。（A：为开始用药时肿瘤体积，B：为处死时肿瘤体积）同时每日观察记录裸鼠精神、活动、进食等情况。

2.3 HE染色 采用HE染色观察各组裸鼠病理学改变。取给药30天后的各组裸鼠肿瘤、癌旁组织和肺组织，于10%甲醛中固定，洗涤脱水后浸蜡包埋制备病理切片，苏木素和伊红染色染色后封片，于200倍光镜下观察各组裸鼠组织病理变化。

2.4 Western blot检测瘤体组织 Bcl-2、Bax、Casp-3蛋白表达 瘤体组织（每200mg加1mL 0.9%生理盐水）RIPA裂解液后手动匀浆器研磨。置于冰上裂解30min；12000rpm离心 5min，取上清。酶标仪A562nm波长测定组织的总蛋白浓度。配制5%浓度的SDS-PAGE浓缩胶，加入适量蛋白后电泳、转膜、封闭、抗原抗体反应后在暗室中用X胶片显影，以GAPDH作内参，用图像分析软件Image J进行各组条带灰度测定。

2.5 qPCR检测瘤体组织Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA水平 将瘤体组织（每200mg加1mL0.9%生理盐水）放入Trizol的匀浆管中，将裂解后样品室温放置5～10min，使得核蛋白与核酸完全分离，按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA，进行逆转录反应，反应条件为 42℃，15min；85℃，5min。随后进行qPCR 反应，反应条件：95℃，10min变性；95℃，15s；60℃，60s；40次循环。用△△Ct法进行各基因表达的相对定量分析。

2.6 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差（±s） 表示，不同组间两两比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）中的 LSD 法（最小显著性法），P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 乌骨藤C21甾体苷抑瘤率检测结果 连续注射给药C21甾体苷4周后，与SACC-83模型组比较，SACC-83 C21甾体苷组肿瘤终体积显著下降（P＜0.05），且抑瘤率达26.8%；与SACC-LM模型组比较，SACC-LM C21甾体苷组的肿瘤终体积显著下降（P＜0.05），抑瘤率为 24.8%。见表1，插页图1。

图1 各组裸鼠肿瘤大小

图2 各组裸鼠肿瘤、癌旁组织和肺组织HE染色结果（×200）

图3 Western blot检测C21甾体苷对各组瘤体组织中Bcl-2、Bax和Caspase3蛋白表达的影响

表1 各组裸鼠肿瘤终体积及抑瘤率（±s）

表1 各组裸鼠肿瘤终体积及抑瘤率（±s）

注：与各自模型组比较，*P＜0.05

鼠数 肿瘤终体积（mm3） 抑瘤率（%）组别SACC-83模型组SACC-83 C21甾体苷组SACC-LM模型组SACC-LM C21甾体苷组6 6 6 6 317.7±58.6 232.6±32.8*394.1±28.9 296.5±38.8*26.8 24.8

3.2 荷瘤裸鼠HE染色形态学变化 各组裸鼠肿瘤、癌旁组织和肺组织HE染色结果如插页图2所示。肿瘤组织HE染色显示，SACC-83模型组和SACC-LM模型组细胞排列紊乱，细胞数目多，细胞核大且染色深，坏死范围较小；SACC-83 C21甾体苷组和SACC-LM C21甾体苷组药物治疗后的细胞数量较模型组均有所减少，细胞生长受到抑制，坏死面积较多。癌旁组织HE染色可见SACC-83模型组和SACC-LM模型组癌旁组织细胞排列松散，大小不一，胞浆丰富红染，有炎症浸润现象；SACC-83 C21甾体苷组和SACC-LM C21甾体苷组的细胞排列规则紧密，细胞数目增多，炎症浸润减弱。肺组织HE染色可见SACC-83模型组和SACC-LM模型组的肺组织可见肿瘤细胞转移，细胞存在一定损伤，肺水肿且肺泡壁增厚；SACC-83 C21甾体苷组和SACC-LM C21甾体苷组的肺损伤程度减轻，可见较少肿瘤细胞转移发生。

3.3 C21甾体苷对各组瘤体组织中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表达的影响 与对于Bcl-2蛋白水平，SACC-83 C21甾体苷组和SACC-LM C21甾体苷组的Bcl-2蛋白水平与各自模型组比均显著下调（P＜0.01），且 SACC-83 C21甾体苷组比 SACC-LM C21甾体苷组下调更明显（P＜0.01）。对于Bax蛋白水平，SACC-83 C21甾体苷组和SACC-LM C21甾体苷组与各自模型组比均显著上调（P＜0.01），且SACC-83 C21甾体苷组比SACC-LM C21甾体苷组上调更明显（P＜0.01）。对于 caspase-3 的蛋白水平，SACC-83C21甾体苷组和SACC-LM C21甾体苷组与各自的模型组比均显著上调（P＜0.01），且 SACC-83 C21甾体苷组比SACC-LM C21甾体苷组上调更明显（P＜0.01）。见表2和插页图3。

表2 C21甾体苷对各组瘤体组织中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达的影响（±s）

表2 C21甾体苷对各组瘤体组织中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达的影响（±s）

注：与各自模型组比较，*P＜0.01；与 SACC-LM C21甾体苷组比较，△P＜0.01

组别SACC-83模型组SACC-83 C21甾体苷组SACC-LM模型组SACC-LM C21甾体苷组鼠数6 6 6 6 Bcl-2 1.000±0.069 0.563±0.072*△1.155±0.071 0.664±0.061*Bax 1.000±0.072 1.969±0.181*△0.844±0.062 1.521±0.120*caspase-3 1.000±0.093 3.028±0.256*△0.890±0.036 1.934±0.188*

表3 C21甾体苷对各组瘤体组织中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表达的影响（±s）

表3 C21甾体苷对各组瘤体组织中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表达的影响（±s）

注：与各自模型组比较，*P＜0.01；与 SACC-LM C21甾体苷组比较，△P＜0.01

组别SACC-83模型组SACC-83 C21甾体苷组SACC-LM模型组SACC-LM C21甾体苷组鼠数6 6 6 6 Bcl-2 1.002±0.072 0.563±0.014*△1.172±0.133 0.649±0.065*Bax 1.005±0.122 1.660±0.227*△0.817±0.071 1.313±0.115*caspase-3 1.001±0.040 2.604±0.174*△0.886±0.087 1.746±0.080*

3.4 C21甾体苷对各组瘤体组织中Bcl-2、Bax和caspase-3基因的mRNA水平的影响 对于Bcl-2，SACC-83 C21甾体苷组和SACC-LM C21甾体苷组的mRNA水平与各自模型组比均显著降低（P＜0.01），且SACC-83 C21甾体苷组比SACC-LM C21甾体苷组下降更明显（P＜0.01）。对于 Bax，SACC-83 C21甾体苷组和SACC-LM C21甾体苷组的mRNA水平与各自模型组比均显著升高（P＜0.01），且 SACC-83 C21甾体苷组比SACC-LM C21甾体苷组升高更明显（P＜0.01）。对于 caspase-3，SACC-83 C21甾体苷组和SACC-LM C21甾体苷组的mRNA水平相较于各自的模型组均显著升高（P＜0.01），且 SACC-83 C21甾体苷组比SACC-LM C21甾体苷组升高更明显（P＜0.01）。见表3。

4 讨论

C21甾体苷主要分布于萝藦科植物如乌骨藤、白首乌中，因其重要的药用价值而受到国内外学者的广泛关注。Yin等[4]研究发现，C21甾体苷能够有效抑制肝癌细胞（HepG2）的增殖，且可通过诱导G1期阻滞，上调caspase-3、caspase-9和Bax表达，下调Bcl-2表达水平，从而诱导肝癌细胞的凋亡。Ye等[7]发现暴露于21.6μM C21甾体苷中的人胃癌细胞（SGC-7901）显示出典型的细胞凋亡形态学的特性，如核染色质凝聚和凋亡小体的形成，流式细胞术分析显示凋亡细胞的百分比增加至43.2%，且caspase-3表达和活性增加3倍。王冬艳等[8]同样发现C21甾体苷处理后的肝癌细胞电镜下可见凋亡的形态学改变，免疫组化结果表明C21甾体苷可显著降低高表达的Bcl-2水平从而促进肝癌细胞的凋亡。众多研究表明，C21甾体苷可以通过调控凋亡基因的表达诱导癌细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的发生发展。

本实验结果显示，C21甾体苷能显著抑制肿瘤的增长，SACC-83组和SACC-LM组的抑瘤率分别为26.8%和24.8%。病理学结果显示，C21甾体苷药物治疗后能抑制肿瘤的增殖和转移，促进肿瘤组织凋亡坏死，减轻肺转移和癌旁组织损伤。Western blot结果显示，C21甾体苷治疗后能显著下调肿瘤组织Bcl-2蛋白表达水平，上调caspase-3和Bax蛋白表达水平。qPCR结果同样表明，C21甾体苷治疗后能显著抑制Bcl-2 mRNA表达水平，上调caspase-3和Bax mRNA表达水平。

细胞凋亡有外源性死亡受体途径和内源性线粒体两条途径，最终信号都会传导至细胞凋亡的执行者caspase，活化的caspase会激活核酸内切酶，DNA链断裂，细胞结构崩解，细胞凋亡[9]。Caspase是细胞凋亡的主要推动力，而caspase-3则被认为是细胞凋亡过程中最主要的执行者。研究发现，Bcl-2参与SACC的发生，且Bcl-2在终末期SACC中显著高表达并与SACC的恶性程度及组织学分期显著相关[10-11]。在SACC中，致癌基因PIM激酶的抑制剂SGI-1776则是通过增加caspase-3的活性，降低Bcl-2的表达，诱导细胞周期停滞和线粒体去极化，从而引起的细胞凋亡[12]。本实验中，Western blot和qPCR分析同样发现Bcl-2在SACC-83及SACC-LM细胞株荷瘤裸鼠中呈高表达，而caspase-3和Bax的表达水平则较低。C21甾体苷治疗后下调了高表达的Bcl-2水平，上调caspase-3和Bax表达水平，表明C21甾体苷可介导细胞凋亡信号传导通路促进肿瘤细胞凋亡进程，从而对SACC起到显著的抑制作用。

综上所述，C21甾体苷可显著抑制肿瘤体积的增长，下调Bcl-2表达水平，上调caspase-3和Bax表达水平，诱导SACC的细胞凋亡，从而对SACC起到抑制作用。本实验可能为C21甾体苷治疗SACC提供理论依据和临床参考，但其远期效果和确切机制，有待进一步研究。