姜黄素对非酒精性脂肪性肝炎肝细胞凋亡的影响

李兵兵 陆其明 杨志宏 季 霞 阙扬铭 周雪峰

姜科植物姜黄是一种天然调味品和食用色素原料，其主要成分之一姜黄素是一种酚类物质，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调节细胞凋亡等作用，且价格低廉、毒性低，已被各国学者广泛应用于肝脏疾病的相关基础和临床研究，虽然多项研究及我们的实验均表明姜黄素可延缓非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的发生发展，但其机制尚不十分明确。近年研究[1]表明，肝细胞凋亡在NASH的发生、发展过程中起着非常重要的作用，且姜黄素对非肿瘤细胞的抗凋亡作用已被证实，并已用于多种相关疾病的研究，但国内外关于姜黄素对NASH的抗细胞凋亡作用及机制的相关研究并不多。因此，本实验通过观察姜黄素对NASH模型肝细胞凋亡的影响，为该中药用于防治NASH提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料 HL-7702细胞（杭州浩克生物技术有限公司），姜黄素（Sigma，78246-100MG），棕榈酸（Sigma，P0500-10G），油酸（Sigma，O-1008-1G），活性氧检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，S0033），线粒体膜电位检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，C2006-100T），1640 培养基（Biologi cal，10437028），胎牛血清（GIBICO，10437028），0.25%Trypsin（GIBICO，25200056），二甲基亚砜（Sigma，D2650）、Annexin V-FITC/PI Staining Solution、细胞凋亡检测试剂盒（Yeasen，40302ES50），荧光显微镜（Olympus，CKX41），离心机（长沙东旺，TD5K-II），CO2培养箱（Thermo，311），自动化酶免分析仪（北京天石医疗用品制作所，SM-3），流式细胞仪（BD，FACSCalibur）。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养 人正常肝HL-7702细胞用含10%胎牛血清的1640培养液，于37℃、5%CO2的温箱中培养72h，细胞70%～80%融合时，用不含EDTA的胰酶消化传代，更换培养液。

1.2.2 药物干预及分组处理 取对数生长期的细胞1×105/mL种植到96孔板孵育24h后，实验分为对照组、模型组、治疗组（20μmol/L姜黄素）。对照组用原培养液培养，模型组、治疗组均用内含浓度为1.0mmol/L 的游离脂肪酸（FFA，PA：OA=1：2）的培养基培养，48h后收集细胞，分别进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况、根据试剂盒说明进行活性氧及线粒体膜电位检测。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化后，300g、4℃离心5min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞 2次，收集 1～5×105细胞。加入 100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，取 5μL Annexin VFITC和5μL PI Staining Solution加入细胞悬液中混匀，避光，室温反应 10min，加入 400μL 1×Binding Buffer混匀后于1h内用流式细胞仪检测。用CellQuest流式软件进行分析，绘制双色散点图。

1.2.4 线粒体相关检测 分别用活性氧检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒测定各组ROS及膜电位的变化。

1.3 统计学方法 应用SAS8.1统计软件进行数据的统计处理，计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（±s） 表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组肝细胞凋亡率比较 Annexin V-FITC标记早期凋亡细胞，PI标记中晚期凋亡细胞。Annexin V-FITC为横坐标，代表绿色荧光强度；PI为纵坐标，代表红色荧光强度。三组间早期凋亡率及总凋亡率差异有统计学意义（P=0.00，0.00），而中晚期凋亡率差异无统计学意义（P=0.13）；模型组与对照组比较，早期凋亡率及总凋亡率均明显增高（P＜0.05），而治疗组与模型组比较，早期凋亡率及总凋亡率均明显降低（P＜0.05），见表1、插页图1。

图1 三组肝细胞凋亡的流式检测结果（Q1：机械损伤；Q2：中晚期凋亡；Q3：正常；Q4：早期凋亡）

图2 三组肝细胞ROS含量流式检测结果

图3 三组肝细胞荧光显微镜下表现（JC-1染色 ×200）

表1 三组肝细胞凋亡率比较（%，±s）

表1 三组肝细胞凋亡率比较（%，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；对照组用原培养液培养，模型组、治疗组均用内含浓度为1.0mmol/L的游离脂肪酸（FFA，PA：OA=1：2）培养基培养，治疗组加 20μmol/L 姜黄素

组别对照组模型组治疗组F值P值孔数5 5 5早期凋亡率0.55±0.08 10.34±0.13*0.83±0.35△1957.51 0.00中晚期凋亡率1.59±0.87 2.96±0.04 2.28±0.82 2.94 0.13总凋亡率2.15±0.91 13.30±0.10*3.11±1.06△175.85 0.00

2.2 三组肝细胞内活性氧（ROS）含量比较 三组间ROS含量差异有统计学意义（P=0.02）；模型组肝细胞ROS含量明显高于对照组（P＜0.05），治疗组低于模型组（P＜0.05），见表2、插页图2。

2.3 三组肝细胞线粒体膜电位的比较 肝细胞JC染色后采用荧光酶标仪进行定量检测，红/绿荧光比值代表线粒体膜电位。三组间线粒体膜电位差异有统计学意义（P=0.00）；模型组的线粒体膜电位低于对照组（P＜0.05），治疗组该指标较模型组升高，但仍低于对照组（P＜0.05），见表2、插页图3。

3 讨论

NASH的持续存在已成为肝硬化甚至肝癌的重要因素之一，约有10%～25%的NASH患者在10～20年内进展为肝硬化，甚至肝癌[2]。肝细胞凋亡在NASH的发生发展过程中起着非常重要的作用。实验证实NASH患者肝组织活检标本的肝细胞凋亡数较单纯脂肪肝组或正常对照组显著升高，并随NASH炎症及纤维化严重程度增加而增加[3]。本实验通过1mmol/L的FFA干预正常人肝细胞来建立NASH的体外细胞模型，结果显示，模型组细胞的早期凋亡率及总凋亡率均较对照组高（P＜0.05），再次证实了肝细胞凋亡在NASH发展中的作用。

表2 三组肝细胞的ROS含量及线粒体膜电位比较（±s）

表2 三组肝细胞的ROS含量及线粒体膜电位比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组，△P＜0.05；对照组用原培养液培养，模型组、治疗组均用内含浓度为1.0mmol/L的游离脂肪酸（FFA，PA：OA=1：2）培养基培养；ROS：活性氧

组别对照组模型组治疗组F值P值孔数5 5 5 ROS含量187.24±10.60 233.58±8.00*192.57±23.86△7.76 0.02线粒体膜电位1.25±0.04 1.08±0.03*1.17±0.04△16.23 0.00

近年研究发现，NASH动物模型及患者肝脏中均存在线粒体结构及功能的异常，包括线粒体呼吸链异常、ROS生成增加、腺苷三磷酸（ATP）合成减少及线粒体膜电势损伤等[4]，而这些改变是肝细胞凋亡的主要原因，同时病理条件下的过度肝细胞凋亡，不仅直接破坏肝细胞并损伤线粒体的结构和功能，而且使活化的肝星状细胞（HSC）与库普弗细胞，释放大量炎性细胞因子，诱导肝脏炎症反应，促进肝脏纤维化的形成和进展[3，5]。高脂饮食喂养的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型中，肝细胞凋亡增加，同时伴随着线粒体膜转换孔开放及凋亡蛋白含量的改变[6]。

姜黄素对非肿瘤细胞的抗细胞凋亡作用已被证实，且已有动物实验表明，姜黄素可显著降低高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝细胞凋亡水平[1]。本研究结果证实了姜黄素的抗细胞凋亡作用，同时，姜黄素显著降低了ROS的生成[7-8]。线粒体是ROS生成的主要部位，线粒体途径是细胞凋亡的关键途径，而膜电位是反应线粒体功能的重要指标，Dai等[9]在细胞实验中发现，姜黄素预处理可明显改善呋喃唑酮诱导的LO2肝细胞的氧化应激，显著减低线粒体膜电位的丧失及促凋亡相关蛋白的表达，从而发挥抗细胞凋亡作用。本研究首次将姜黄素用于FFA诱导的NASH细胞模型并检测线粒体膜电位的变化，结果显示，与模型组相比，该指标的组间差异具有统计学意义（P＜0.05），表明姜黄素可保护线粒体膜电位。上述实验结果均表明姜黄素降低ROS的生成及肝细胞凋亡，减弱线粒体膜电位的损伤，故姜黄素的抗凋亡作用可能与其线粒体保护作用相关。