桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠血糖血脂和抗氧化能力的影响

王祖文，秦樱瑞，黄先智，丁晓雯,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆 400716；2.西南大学科技处，重庆 400716）

随着社会环境和饮食习惯的改变，肥胖、高血糖和高血脂等发病率逐年上升，这些疾病已严重危害人类健康[1]。许多药食同源的中药材因含多种具有治疗疾病和预防保健作用（如降糖、降脂、增强免疫力、抗衰老等[2-3]）的活性成分而受到人们青睐。从植物资源中开发一些适用一般人群的食品来调节机体功能、减少疾病发生的风险成为近年研究热点。

桑叶、苦瓜均是药食两用植物。大量研究证明，桑叶富含多糖、生物碱、黄酮等功能成分[4]，具有降糖[5-6]、降脂[7-9]、抗氧化[10]等诸多生理功能；苦瓜富含多糖、皂苷和多肽等活性成分，具有降糖[11-12]、降脂[13-14]、抗氧化[15]、抗菌[16]等作用。目前关于桑叶、苦瓜及其提取物降糖、降脂、抗氧化效果的研究已有诸多报道，如Ahmed等[17]报道苦瓜提取物对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病大鼠具有降脂、降糖作用；杭悦宇等[18]报道，苦瓜冻干粉对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠具有良好的降糖作用；Andallu等[19]在STZ诱导的糖尿病大鼠的食物中添加25%（质量分数）干桑叶粉，发现其能抑制糖尿病大鼠肝组织脂质过氧化和过氧化氢酶的活性，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性；Jeszka-Skowron等[6]用桑叶干粉的乙醇提取物灌胃STZ诱导的非肥胖II型糖尿病大鼠，结果表明桑叶具有降血糖、提高胰岛素水平及抗氧化功能。

近几年，本实验室也进行了相关的研究，如邹莉芳等[20]发现桑叶水提物（主要含桑叶生物碱）对高脂饮食小鼠有显著降血脂作用，能有效减少脂肪积累，促进胆固醇代谢；方太松等[21]研究了不同剂量桑叶超微粉奶茶灌胃alloxan诱导的糖尿病小鼠，能显著降低实验小鼠总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）浓度，升高高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）浓度；李玲等[22]研究了桑叶-苦瓜混合粉的体外抗氧化能力，结果表明桑叶-苦瓜在体外抗氧化有协同增效作用；杨敏等[23]报道桑叶-苦瓜混合粉可显著降低糖尿病小鼠TC、TG和LDL-C浓度，升高HDL-C浓度；彭晓蝶等[24]对糖尿病小鼠灌胃不同质量浓度的桑叶-苦瓜混合粉，发现当质量浓度为0.20 g/mL，灌胃30 d后，与模型组相比，糖尿病小鼠体质量下降受到显著抑制，血糖浓度下降率超过40%，肝糖原浓度增加1 倍以上。

桑叶、苦瓜无论是单独还是混合喂饲都对糖尿病实验动物、高脂饮食实验动物均有显著的降糖、降脂、抗氧化作用，特别是混合喂饲能极显著降低糖尿病小鼠血糖，对肝糖原储存能力的增强作用优于二甲双胍（降血糖药物）[23-24]。但长期摄入桑叶-混合苦瓜粉对正常实验动物的血糖、血脂、抗氧化能力是否有调节作用，是否会造成正常动物低血糖等还鲜见报道。为了验证桑叶、苦瓜混合粉对正常实验动物无不利影响，本实验利用桑叶-苦瓜混合粉喂饲正常小鼠，测定其血糖、血脂水平及抗氧化指标并进行分析，以期为桑叶、苦瓜混合粉相关功能保健食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

昆明种清洁级小鼠，体质量25～30 g，购自重庆滕鑫有限责任公司，许可证号：SCXK（渝）2007-006。基础饲料购自重庆滕鑫有限责任公司。

桑叶品种为胜利大叶，由重庆市蚕业科学技术研究院提供，75 ℃热风干燥60 min，粉碎备用[25]（干燥桑叶粉中水分4.45%（质量分数，下同）、DNJ含量227.47 mg/100 g、黄酮含量49.51 mg/g、多糖11.29%）；苦瓜品种为绿玉，购于北碚雄风超市，60 ℃热风干燥8 h，粉碎备用[26]（干燥苦瓜粉中含水分1.22%、皂苷2.31%、多糖7.43%、多肽0.11%）。

稳捷型血糖试纸 美国LifeScan公司；糖原测定试剂盒、SOD测定试剂盒（WST-1法）、GSH-Px测定试剂盒、MDA测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；TC测定试剂盒、TG测定试剂盒、LDL-C测定试剂盒、HDL-C测定试剂盒 四川迈克生物科技股份有限公司；羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

7020型全自动生化分析仪 日本日立公司；Model680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；ONE TOUCHTMBasicTMPlus稳捷基础倍加型血糖监测仪 美国LifeScan公司；S22可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；5810型台式高速离心机 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 桑叶-苦瓜混合粉的制备

根据前期实验结果[24]，将桑叶粉、苦瓜粉按3∶1的质量比混合后，各取5、10、15、20 g混合粉分别溶入100 mL 0.01g/mL的CMC-Na水溶液中，得到质量浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL的桑叶-苦瓜混合液。

1.3.2 小鼠的分组与喂养

实验小鼠于西南大学食品科学学院动物实验房内饲养，室温（23f1）℃，相对湿度约60%，12 h光暗交替处理（7∶00ü19∶00）。实验用正常小鼠100 只，随机分为5 组，每组20 只，雌雄各半，自由进食饮水，适应性喂养1 周。各组小鼠均给予基础饲料喂养，LD组（低剂量组）、MD组（中剂量组）、HD组（高剂量组1）、GD组（高剂量组2）小鼠分别灌胃质量浓度为0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL桑叶-苦瓜混合粉0.5 mL/d，连续灌胃30 d；NC组（对照组）灌胃同等体积的0.01 g/mL CMC-Na。

1.3.3 实验样品采集

1.3.3.1 血清采集与制备

实验小鼠灌胃30 d后，禁食不禁水12 h，完成尾静脉采血测定血糖值后，摘眼球取血，参照Tsuduki等[27]的方法制备血清，收集上清液，分装后于－80 ℃冰箱保存备用。

1.3.3.2 肝匀浆的制备

采血完毕后的小鼠颈椎脱臼处死，打开胸、腹腔，取出肝脏，用冷生理盐水漂洗除去表面血液，滤纸拭干，称质量。准确称取一定量的肝脏样品，加入9 倍体积的生理盐水，在冰浴上研磨制备肝匀浆，于3 000 r/min离心10 min，取上清液，分装后于－80 ℃冰箱保存备用。

1.3.4 指标测定

1.3.4.1 小鼠的体质量测定

在小鼠灌胃前及灌胃后的第6、12、18、24、30天分别测定小鼠的体质量，按公式（1）计算体质量增长率[28]。

式中：m0为小鼠初始体质量/g；m1为喂饲一定时间后小鼠体质量增加量/g。

1.3.4.2 血糖浓度测定

实验小鼠灌胃前和灌胃第15、30天禁食不禁水12 h，用血糖仪测定小鼠空腹血糖浓度。按公式（2）计算血糖下降率[29]。

式中：I1为灌胃前血糖浓度；I2为灌胃后血糖浓度。

1.3.4.3 糖耐量测定

各组小鼠在末次灌胃前禁食不禁水12 h后，尾静脉取血测定血糖作为空腹血糖浓度；灌胃3 h后经口给予葡萄糖2.5 g/kg mb，分别于注射后0.5、1.0、2.0 h尾静脉采血测血糖浓度。参考《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）[30]，按公式（3）计算血糖曲线下面积（area under the curve，AUC）。

式中：cA为空腹血糖浓度/（mmol/L）；cB、cC、cD分别为腹腔注射葡萄糖0.5、1.0、2.0 h后血糖浓度/（mmol/L）。

1.3.4.4 血清及肝匀浆肝糖原、血脂、抗氧化指标测定

采用全自动生化分析仪按照试剂盒说明书测定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C浓度；采用酶标仪按照试剂盒说明书测定肝匀浆中肝糖原含量、SOD、GSH-Px活力及MDA含量。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，实验结果以fs表示，采用Duncan显著性差异检验进行单因素方差分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，P＜0.001为差异高度显著。

2 结果与分析

2.1 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠体质量的影响

体质量能衡量动物包括人的健康状况，超重、肥胖或体质量过轻都不是健康的表现。以小鼠体质量增长率为指标，考察用桑叶-苦瓜混合粉喂饲一定时间对小鼠体质量的影响。

表1 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠体质量增长率的影响Table1 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on body mass gain in normal mice

由表1可知，在实验过程中，所有小鼠体质量均有增加且雄鼠的增长率高于雌鼠，随着桑叶-苦瓜混合粉灌胃质量浓度的增加，正常小鼠体质量增长率逐渐减小并趋于平缓。当灌胃质量浓度为0.15 g/mL，雌、雄鼠的体质量增长率分别为11.26%、18.55%，与NC组相比差异极显著（P＜0.01），说明桑叶-苦瓜混合粉对雌雄小鼠的体质量有显著抑制作用；当质量浓度增加到0.20 g/mL时，抑制作用趋于稳定，与HD组（0.15 g/mL）的体质量增长率无显著差异（P＞0.05）。结果表明，桑叶-苦瓜混合粉对正常雌雄小鼠的体质量增加有较好的控制作用。

2.2 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠血糖浓度的影响

血糖值反应了胰岛β细胞对胰岛素的分泌功能。桑叶、苦瓜均具有降血糖的作用，为考察桑叶-苦瓜混合粉是否会引起正常小鼠血糖浓度过多降低，测定了不同质量浓度桑叶-苦瓜混合粉灌胃30 d对正常小鼠血糖浓度的影响。

表2 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠血糖浓度的影响Table2 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on blood glucose in normal mice

由表2可知，NC组小鼠的血糖浓度一直维持在6.22～7.58 mmol/L范围内，相对稳定。与NC组相比，随着灌胃桑叶-苦瓜混合粉时间的延长和质量浓度的增加，各组小鼠血糖浓度有一定下降，但也维持在4.78～6.46 mmol/L范围内，本实验结果与董英[31]、玄光善[32]等研究中昆明种正常小鼠血糖浓度分别为（5.56f1.21）、（5.05f2.37）mmol/L）接近。结果表明，正常小鼠长时间服用桑叶-苦瓜混合粉，血糖浓度仍维持在正常范围，不会出现低血糖。

2.3 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠糖耐量的影响

糖耐量即对葡萄糖的耐受能力。正常人服用一定量葡萄糖后，血糖浓度先升高，经过一段时间的代谢，葡萄糖在机体合成糖原并加以贮存，血糖浓度恢复到空腹水平。若服糖2 h后血糖浓度仍然保持较高水平，说明糖耐量能力降低，即机体对糖的吸收利用低于正常人[33]。此外，AUC反映葡萄糖被人体利用程度和清除情况，其值增大说明机体糖耐量能力下降，反之则糖耐量能力升高[24]。

表3 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠糖耐量的影响Table3 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on glucose tolerance in normal mice

由表3可知，N C组小鼠0 h血糖浓度为（6.64f0.67）mmol/L，注射葡萄糖后2 h其血糖浓度为（5.94f0.51）mmol/L，与空腹血糖浓度比差异无显著性（P＞0.05），AUC为12.62f0.44，表明NC组小鼠对糖吸收和利用正常。喂饲不同质量浓度桑叶-苦瓜混合粉均能不同程度地降低正常小鼠葡萄糖负荷后的血糖浓度，降低AUC，提高正常小鼠糖耐量。与NC组比较，HD组雌、雄鼠餐后AUC别为10.13f0.62、10.39f0.50（P＜0.001），达到最低，下降率分别为19.73%、18.51%。结果表明，不同质量浓度桑叶-苦瓜混合粉均能显著降低小鼠餐后2 h血糖浓度，具有提高正常小鼠糖耐量的作用。

2.4 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠肝糖原含量的影响

当血糖升高时可在肝脏合成糖原，血糖降低，肝糖原将分解为葡萄糖以补充血糖。因此，肝糖原对维持血糖稳定十分重要[34]。正常饮食能不断补充肝糖原，减少糖原的异生作用。肝糖原的合成和降解受到胰岛素的控制，当胰岛素控制失调，肝糖原的合成也会失调[35]。

表4 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠肝糖原含量的影响Table4 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on hepatic glycogen level in normal mice

由表4可知，N C组小鼠肝糖原含量维持在2.37～2.43 mg/g。随着灌胃桑叶-苦瓜混合粉质量浓度的增加，小鼠肝糖原含量随之增加，呈现明显的剂量-效应关系。与NC组相比，GD组雌、雄小鼠肝糖原含量分别增长了1.93、1.98 倍。结果表明，桑叶-苦瓜混合粉能增加正常小鼠肝糖原的合成，有助于实验小鼠血糖浓度保持在稳定水平。

2.5 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠血脂浓度的影响

血脂是血浆中所含脂类的总称，主要包括胆固醇和甘油三酯，血脂变化可反映体内脂质代谢的情况。血脂水平的升高与动脉粥样硬化的发生有关，尤其是当LDL-C浓度过高，其沉积于动脉血管壁形成粥样斑块；HDL-C可把动脉壁上的胆固醇逆向转运到肝脏中进行代谢后排出体外，从而减少胆固醇在动脉壁上的沉积[36]。在一定程度上降低LDL-C、升高HDL-C浓度有助于预防动脉粥样硬化[37]。

表5 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠血脂浓度的影响Table5 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on blood lipids in normal mice mmol/L

由表5可知，与NC组相比，随着桑叶-苦瓜混合粉灌胃质量浓度的增加，正常小鼠血清TC、TG、LDL-C浓度下降，HDL-C浓度上升。各组之间的LDL-C、HDL-C浓度存在高度显著差异（P＜0.001），呈现剂量-效应关系。与NC组相比，GD组雌鼠TC、TG、LDL-C浓度分别下降17.19%、15.00%、41.67%（P＜0.01，P＜0.001），雄鼠TC、TG浓度无显著变化，LDL-C浓度下降45.83%（P＜0.001）；雌、雄鼠HDL-C浓度分别上升64.52%、72.22%（P＜0.001）。结果表明，桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C浓度有调节作用，特别是对LDL-C、HDL-C浓度影响明显。

2.6 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠抗氧化能力的影响

抗氧化物质可减少机体自由基的产生，降低自由基的副作用。SOD、GSH-Px、MDA是常用的反映组织抗氧化能力和氧化损害程度的指标，其中MDA是脂质过氧化反应的主要代谢产物，可严重破坏细胞膜结构；而SOD、GSH-Px等构成了机体重要的抗氧化酶系统，可减少氧自由基的产生，防止脂质过氧化及其中间代谢产物对机体的损害[38-39]。研究表明，桑叶、苦瓜单独使用均能增强糖尿病鼠的抗氧化能力[40-41]。桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠肝脏抗氧化能力影响的结果如表6所示。

表6 桑叶-苦瓜混合粉对正常小鼠抗氧化指标的影响Table6 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on hepatic antioxidant parameters in normal mice

由表6可知，与NC组相比，随着桑叶-苦瓜混合粉灌胃质量浓度的增加，正常小鼠肝脏SOD、GSH-Px活力随之增强，MDA含量逐渐减少。各组之间的SOD、G S H-P x活力、M D A含量存在高度显著差异（P＜0.001），呈现明显的剂量-效应关系。与NC组相比，GD组雌鼠SOD、GSH-Px活力分别上升41.77%、29.04%（P＜0.001），MDA含量下降36.71%（P＜0.001）；雄鼠SOD、GSH-Px活力分别上升48.41%、27.21%（P＜0.001），MDA含量下降37.73%（P＜0.001）。结果表明，一定剂量的桑叶-苦瓜混合粉可增强正常小鼠的抗氧化能力，减少脂质过氧化物的产生，保护细胞免受氧化损伤，保证肝脏脂质代谢正常。

3 讨 论

本实验室前期研究表明，桑叶-苦瓜联合作用对糖尿病小鼠具有很强的降糖、降脂功能[23-24]。桑叶主要活性成分多糖、生物碱对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，在高质量浓度下具有协同作用[42]，进而发挥降血糖的作用。桑叶中的黄酮类物质一方面可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂[43]，另一方面可作为胰岛素促分泌剂来降低血糖水平[44]。苦瓜皂苷对α-葡萄糖苷酶虽无抑制，但能显著提高正常小鼠糖耐量，恢复胰岛β细胞的活力，刺激肝糖原合成同时抑制肝糖原释放，提高机体肝糖原的贮存能力[45]。苦瓜皂苷还能够增强巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α，诱导和增强SOD和GSH-Px的活力。此外，桑叶和苦瓜均富含多酚类物质，因其具有清除自由基、增强抗氧化能力的作用，可保护机体免受氧化应激的伤害，能有效预防动脉粥样硬化等心血管疾病的发生[46]。

鉴于桑叶、苦瓜两种药食同源植物对糖尿病及高脂血症小鼠均具有降糖、降脂、抗氧化的功效，为了验证桑叶、苦瓜混合使用对正常实验动物无不利影响，本实验采用桑叶-苦瓜混合粉喂饲正常小鼠，实验结果显示，随着灌胃质量浓度增加和时间延长，桑叶-苦瓜混合粉能有效地控制小鼠的体质量增长；不会引起正常小鼠低血糖，同时还能提高正常小鼠血糖调节能力，促进肝糖原合成；此外，一定质量浓度的桑叶-苦瓜混合粉可调节小鼠血脂浓度，有效预防高血脂症，增强抗氧化能力，保护肝脏细胞免受氧化损伤，保证肝脏脂代谢的稳定性。这些结果均表明桑叶和苦瓜混合饲喂对正常实验动物并无不利影响，这为桑叶、苦瓜混合粉开发相关功能保健食品的适用性提供了参考依据。