白术多糖的分子量及其单糖组成分析

王少杰，巴娟，张勇军，邓桦，蒲文珺，杨鸿

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院， 广东 佛山 528231)

中药白术为白术的根茎，切厚片生用或土炒、麸炒用，炒至黑褐色称为焦白术。其性苦、甘、温。归脾、胃经。具有扶植脾胃、散湿除痹、消食除痞、安胎之功效。白术多糖作为中药白术的主要活性成分具有免疫调节作用，能增加脾脏和胸腺的重量，增强小鼠脾淋巴细胞免疫功能，提高T淋巴细胞的转化率和增殖反应，可调节巨噬细胞、白细胞功能，增强机体免疫应答[1-3]。白术多糖具有抗氧化、抗衰老、降血糖、抗肿瘤、促进胃肠粘膜损伤修复等作用[4-11]。白术多糖还可应用于抗菌消炎、抑制痢疾杆菌与伤寒杆菌、提高抗氧化功能、抑制红细胞溶血、促发育、提高机体免疫力、抗肿瘤、抑制血液凝固、扩张血管、保护放射线侵害等诸多方面[12-14]。

中药多糖的质量控制标准不完善(仅检测总糖含量)，会对市场秩序产生一定的影响。本试验通过对白术多糖的提取、纯化，采用高效凝胶色谱(HPLC-GPC)法测定白术多糖的分子量大小及分布情况，采用薄层色谱(TLC)法及柱前衍生化HPLC法进行单糖组成种类和物质的量比的测定，为实现有效地对白术多糖进行质量控制提供了一种可靠的定性定量检测方法，可作为白术多糖质量标准制定的参考与借鉴。

1 材 料

1.1 仪器 真空冷冻干燥机：美国LABCONCO公司；RE-201D旋转蒸发仪：郑州予华仪器制造有限公司；雷蒙实验室专用超纯水机：重庆利迪实验室仪器设备有限公司；HN1012超声波清洗机：广州市华南超声设备有限公司；不锈钢电热去离子水器：上海传胜实验设备有限公司；XZ-1型真空泵：黄岩求精真空泵厂；BSA224S-CW电子分析天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：岛津企业管理(中国)有限公司；岛津DGU-20A系列高效液相色谱仪：岛津企业管理(中国)有限公司；G1362A示差折光检测器(RID)：安捷伦科技(中国)有限公司；雷磁PHS-3C PH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；H1650-W台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 试剂 中药白术购自北京同仁堂药店佛山分店；AB-8大孔树脂、无水乙醇均为分析纯；D-甘露糖(批号：140651-201403)、鼠李糖(批号：111683-201502)、D-核糖(批号：140668-201302)、D-半乳糖醛酸(批号：111646-200301)、阿拉伯糖(批号：1506-200001)、D-木糖(批号：111508-200404)、果糖(100231-201305)对照品购自中国食品药品检定研究院；D-葡萄糖(批号：201705)、D-半乳糖(批号：201705)对照品购自上海瑞楚生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(TFA)、盐酸、氢氧化钠、丙酮、正丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、苯胺、二苯胺、磷酸均为分析纯；乙腈、甲醇均为色谱纯。

2 方 法

2.1 白术多糖的制备及含量测定[15]将中药白术采用L9(34)正交试验设计优化水提醇沉淀的提取工艺，提取条件为提取温度90 ℃、料液比1∶16、提取时间1.5 h，重复提取3次。将提取的粗多糖经AB-8大孔树脂纯化浓缩，真空冷冻干燥即得精制多糖，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

2.2 白术多糖分子量与化学均一性检测

2.2.1 色谱条件 岛津DGU-20A系列高效液相色谱仪；G1362A示差折光检测器(RID)；高效液相色谱柱：SB-806M HQ(8.0 mm×300 mm)；TSK PWXL保护柱(6.0 mm×40 mm)；流动相：超纯水；流速：0.7 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

2.2.2 进样溶液配制 分别称取9个T-dextran系列葡聚糖标准品(相对分子量7000-700000 Da)各2 mg，1 mL去离子水溶解，离心(6000 rpm，5 min)后取上清液，采用相同方法分别配制白术多糖溶液。

HPLC-GPC法测定多糖的数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、Z均分子量(Mz)。由岛津数据分析软件分析处理得出。根据多糖样品的色谱图判断多糖的化学均一性。

2.3 柱前衍生化HPLC法检测白术多糖的单糖组成

2.3.1 水解多糖样品 称得两份50 mg纯化后的多糖样品，分别放入不同的10 mL具塞试管与2 mol/L的三氟乙酸溶液2 mL混合均匀，置于97 ℃水浴锅反应8 h，然后用4 mol/L NaOH调节PH至中性，离心并过滤。

2.3.2 多糖与单糖样品衍生化 分别将5 mg的D-甘露糖、D-半乳糖、D-核糖、鼠李糖、D-葡萄糖、阿拉伯糖D-半乳糖醛酸定容于25 mL容量瓶中即可得到单糖标准品的混合样品。取100 μL混合单糖标准品、 50 μL的0.3 mol/L NaOH溶液、50 μL的0.5 mol/L PMP 甲醇溶液充分混合，水浴加热30 min。冷却后加入 50 μL的0.3 mol/L HCl中和溶液，分别以1 mL 氯仿进行3次萃取，经0.22 μm微孔滤膜滤过，备用[16]。用同样的方法进行衍生化处理白术多糖水解样品100 μL。

2.3.3 色谱条件 Wondasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为磷酸盐缓冲溶液(pH6.9)-乙腈(85∶15)；40 ℃柱温；1.0 mL/min流速；20 μL进样量；254 nm检测波长。以混合单糖标准品和白术多糖水解样品的衍生化产物进行测定，得到分离良好的色谱峰。

2.3.4 方法学试验 精密度考察：取衍生化后的标准品连续进样6次，以峰面积的RSD值考察试验的仪器精密度；重复性考察：取衍生化产后的白术多糖样品连续进样6次；稳定性考察：取白术多糖的衍生化产物分别于0、2、4、8、16、24 h进样。回收率考察：于样品中分别加入样品含量一半的100%、120%和150%的单糖标准品混合溶液进行测定。

2.3.5 线性试验 分别进样1、2、4、6、8、10 μL单糖标准品混合溶液，对各单糖用峰面积进行质量浓度回归。

2.3.6 各单糖的物质的量比[17]计算方法：按式①、②计算两种单糖之间的校正因子f1/2和这两种单糖的比例R1/2。

① f1/2=(A2/m2)/(A1/m1)

A1、A2 分别为混合标准品溶液中单糖1、2 的峰面积，m1、m2 分别为标准品溶液中单糖1、2 的质量浓度。

② R1/2=f1/2×(A'1/A'2)

A'1、A'2分别为样品中单糖1、2的峰面积。

3 结果与分析

3.1 白术多糖制备和含量测定 最佳提取条件为：浸提时间1.5 h、浸提温度90 ℃、提取次数3次，之后抽滤、浓缩提取液，无水乙醇沉淀浓缩液12 h，取沉淀物经真空干燥，得白术粗多糖。经AB-8大孔树脂纯化的白术多糖含量可达91%以上。

3.2 白术多糖分子量及化学均一性检测结果 经HPLC-GPC法检测，白术多糖的化学均一性良好，基本呈现单一峰形，见图1。经测定，白术多糖中Mw≈3500小分子多糖占其97%，Mw≈50000000的大分子占其3%；从多糖样品的聚合物分散性指数(PDI)可以看出白术多糖的PDI较小，分子量分布较均匀，结果见表1。

表1 白术多糖分子量分布结果Tab 1 Results of molecular weight distribution of atractylodes macrocephala polysaccharide

图1 白术多糖HPLC-GPC色谱及分子量分布图Fig 1 HPLC-GPC chromatography and molecular weight distribution of atractylodes macrocephalaon polysaccharides

3.3 柱前衍生化HPLC法检测白术多糖的单糖组成结果

3.3.1 方法学试验 精密度考察：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分别为1.13%、0.90%、0.49%、0.70%、0.57%、1.53%、1.52%；D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的RSD值分别为0.38%、0.55%、1.34%、1.61%；稳定性考察：D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分别为0.46%、0.43%、0.69%、1.33%。表明样品溶液在24 h内稳定。回收率试验：计算得D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分别为98.8%，98.5%，98.6%，97.2%；RSD值为1.40%，0.30%，0.68%，1.18%。

3.3.2 线性试验 对各单糖用峰面积进行质量浓度回归，线性结果见表2。

表2 单糖标准曲线方程Tab 2 Standard curve equation of monosaccharide

3.3.3 单糖对照品与白术多糖的HPLC分析色谱图 将单糖标准品混合样品与白术多糖的衍生化产物进行HPLC分析，结果显示：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的衍生化物分别在22.76、27.95、31.34、33.59、44.38、49.47、53.62 min左右出现吸收峰，见图2；对比白术多糖图谱，在部分相同的位置有吸收峰与其对应。可以确定白术多糖由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖4种单糖组成，见图3。

3.3.4 白术多糖的物质的量比 通过计算得出白术多糖中D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的物质的量比为1∶239∶18.6∶19.3，结果见表3。

表3 白术多糖中各单糖的物质的量比计算结果Tab 3 The ratio of the amount of monosaccharide substance in atractylodes macrocephalaon polysaccharides

1 D-甘露糖，2 D-核糖，3 鼠李糖，4 D-半乳糖醛酸，5 D-葡萄糖，6 D-半乳糖，7 阿拉伯糖1 D-mannose, 2 D-ribose, 3 Rhamnose, 4 D-galactose uronic acid, 5 D-glucose, 6 D-galactose, 7 Arabia sugar图2 单糖对照品HPLC分析色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of monosaccharide control article

1 D-甘露糖，5 D-葡萄糖，6 D-半乳糖，7 阿拉伯糖1 D-mannose,5 D-glucose, 6 D-galactose, 7 Arabia sugar图3 白术多糖HPLC分析色谱图Fig 3 HPLC chromatogram of atractylodes macrocephalaon polysaccharides

4 讨论与结论

4.1 方法条件优化

4.1.1 提取工艺优化 中药白术采用L9(34)正交试验设计优化水提醇沉淀的提取工艺，得出的最佳提取条件为提取温度90 ℃、料液比1∶16、提取时间1.5 h，重复提取3次；通过与三氟三氯乙烷法、Sevag法、酶法、三氯乙酸法、透析膜透析法等方法对比后，最终选择纯化效果最好的“AB-8大孔树脂法”进行纯化。

4.1.2 分子量测定方法的选择 通过与黏度法、光散射法和超速离心沉降速度法等方法对比以后，选择用GPC法测定白术多糖的分子量是因为GPC法相比之下测定更加精确，操作便捷，可以根据相关软件快速准确地分析实验结果。

4.1.3 白术多糖单糖组成方法的选择 在用高效液相色谱法分析多糖组成及其含量时，由于多糖和单糖都不具有紫外吸收，无法直接对其进行测定，所以一般采用凝胶色谱柱与示差折光检测器或蒸发光散射检测器等仪器，这些方法不仅灵敏度低、基线噪音大、柱温对结果影响较大、测定过程中易发生单糖转化并且这些仪器与色谱柱价格高昂。因此本试验先对YPF-P进行水解和衍生化处理，再采用高效液相色谱法(HPLC)分析其单糖组成及其物质量比，此方法不仅可以准确高效地测定白术多糖的单糖组成还极大地降低了检测成本。

4.2 结论 通过对白术多糖的分子量测定，可以了解白术多糖的分子量大小以及分子量分布情况。通过柱前衍生化HPLC法对白术多糖进行单糖组成种类和物质的量比的测定，可以实现对白术多糖准确的定性定量。试验通过对白术多糖的分子量大小与分布情况以及单糖组成分析，对白术多糖进行了定性定量的考查。试验建立的方法稳定性高、重复性好、样品用量少、容易操作。研究为白术多糖实现质量控制提供了一种可靠的定性定量的新思路。