HBV聚合酶活性区变异与临床病情变化及HBsAg阳性相关性

夏 红，杨 强

(重庆市大足区人民医院感染科，重庆 402360)

我国是乙型肝炎高发国，HBV反复、持续感染是一系列肝脏疾病的危险因素，包括肝炎性、肝硬化、肝癌等[1]。目前，抗病毒治疗是防止乙肝发展为肝硬化、肝癌的主要疗法；核苷酸类药物如拉米夫定可以通过抑制HBV DNA复制，从而有效治疗HBV感染，而且是主要的抗病毒药物[2]。研究显示，治疗可以显著改善HBV感染患者的临床、生化和病毒学等指标，且使肝组织炎性坏死等病理损害明显好转[3]。但研究显示，拉米夫定络氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(tyrosine methionine aspartate aspartate, YMDD)变异率随着抗病毒治疗时间延长而逐渐增高[4]，并认为这些变异可能是治疗失败或产生耐药性的原因[5]。本文研究HBV聚合酶YMDD变异与乙型肝炎临床病情变化及HBsAg的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014至2016年间在本院就诊的慢性乙型肝炎患者290例，均符合2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》慢性乙型肝炎诊断标准[6]。其中男196例，女94例，年龄17～76岁，平均年龄(47.5±13.7)岁。无症状携带者(asymptomatic carriers, ASC)56例，急性肝炎(acute hepatitis, AH)55例，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)68例，肝硬化(cirrhosis of liver, LC)53例，重型肝炎(severe hepatitis, SH)31例，原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma, PHC)27例。患者接受拉米夫定治疗12～48月，平均(31.5±6.5)个月。分别于治疗前及治疗中每4～6月抽取患者外周血，分离血清，-70 ℃储存，待测。

1.2 试剂

使用ABI 7700荧光PCR扩增仪(美国BIO～RAD公司)、乙型肝炎病毒核酸扩增(polymerase chain reaction, PCR)荧光定量试剂盒及YMDD变异检测试剂盒(广州市达晖生物技术有限公司)测定缬氨酸突变型(tyrosine valine aspartate aspartate,YVDD)对照品、异亮氨酸突变型(tyrosine isoleucine aspartate aspartate,YIDD)突变类型；使用人乙肝表面抗原(HBsAg)Elisa试剂盒(上海广锐生物科技有限公司)测定HBsAg。

1.3 实验方法

1.3.1 HBV变异检测 (1)样本处理：取50 μL待测血清标本、阴性血清对照品、强阳性和临界阳性于1.5 mL离心管中，分别加入50 μL核酸提取液，混匀，2 000 rpm离心10 s，100 ℃水浴10 min，12 000 rpm离心10 min，取上清，-20 ℃保存，待测。(2)上样：在HBV反应混合液A的反应管中分别加入4 μL的阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照、待检测样品处理上清液、HBV定量标准品。在HBV反应混合液B和C的反应管中分别加入4 μL的强阳性对照、待检测样品处理上清液、YVDD对照品、YIDD对照品。盖紧反应管，转移至检测区。(3)PCR扩增及荧光检测：反应管置于PCR仪上进行扩增，扩增条件：37 ℃ 2 min；95℃ 5 min；94 ℃ 20 s，62 ℃ 60 s，循环40次，荧光检测。(4)结果分析：如果样品的反应混合液B检测阴性，反应混合液C检测阳性，则可判定该样品为YIDD突变株。如果样品的反应混合液B检测阳性，反应混合液C检测阴性，则可判定该样品为YVDD突变株。如果样品的反应混合液B检测阴性，反应混合液C检测阴性，则可判定该样品为野生型株。如果样品的反应混合液B检测阳性，反应混合液C检测阳性，则判定该样品为YVDD、YIDD共生株。

1.3.2 生化指标检测 使用全自动生化检测仪检测血清AST、ALT、ALP和TBIL表达水平。

1.3.3 HBsAg检测 抽取患者静脉血，收集血清。设置空白孔和待测样品孔。待测样品孔中依次加入40 μL样品稀释液、10 μL待测样品，轻摇混匀，37 ℃×30 min，洗板5次；加入50 μL酶标试剂，37 ℃×30 min，洗板5次；依次加入显色剂A和B各50 μL，轻摇混匀，避光37 ℃×15 min，终止反应；以空白孔调零，依序测量各孔吸光度(450 nm)；绘制标准曲线，代入样品OD值计算出浓度，再乘以稀释倍数，即实际浓度。空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同。

肝穿刺：患者取仰卧位，穿刺点位于右侧腋中线第8和第9肋间、肝实音处穿刺，局部皮肤消毒，肝被膜用2%利多卡因局部麻醉，三棱针刺孔，由刺孔刺入穿刺针，注射器推出0.5～1.0 cm防止针头堵塞，注射器抽成负压并保持，叮嘱患者吸气，深呼吸末屏住呼吸，将穿刺针刺入肝内并抽出，生理盐水冲出肝组织条，10%甲醛固定送检。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 患者一般情况分布特征

病毒变异组和无变异组的性别、年龄、病程、乙肝疫苗接种史和HBV家族感染史等一般临床资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 患者一般情况特征分布

2.2 病毒变异与患者病情分布的关联

病毒变异组与无变异组的病情分布差异有统计学意义(P<0.05)；病毒变异组患者的肝功能指标表达水平与无变异组差异有统计学意义(P<0.05)，病毒变异组AST、ALT、ALB和TBIL水平显著高于无变异组。见表2。

表2 两组患者病情分布特征

2.3 病毒变异与无变异患者HBsAg阳性率及表达方式对比

变异组140例患者中，肝细胞内HBsAg表达阳性104例，阳性率为74.29%，无变异组150例患者中，肝细胞内HBsAg表达阳性91例，阳性率为60.67%，变异组显著高于无变异组(χ2=4.541，P=0.033)。变异组的HBsAg表达方式主要以浆核型为主，约占阳性表达患者的47.25%，无变异组的表达方式主要以核型为主，约占阳性表达患者的46.15%，两组表达方式差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 病毒变异与患者HBsAg阳性率及表达方式 (例，%)

3 讨 论

HBV DNA复制起始于蛋白启动的逆转录机制，HBV聚合酶蛋白在其中发挥关键作用[7]；但由于HBV聚合酶缺乏3′～5′校对能力，发生核苷酸替代变异后难以修正，所以HBV是一个高度变异的病毒，而这些突变以准种的形式存在于体内，病毒准种的进化依赖于抗病毒药物、免疫应答、复制适用性等为更强适用性的变异株提供复制空间[8]；与野生株相比，HBV突变株在没有药物压力下复制能力较低，但抗病毒药物治疗可以改变宿主机体内环境，使变异株的复制适用性超过野生株。一段时间后，野生株感染的肝细胞以细胞更新的方式被清除，并取代以未感染的细胞，而未被感染的细胞很容易被变异株感染[9]。研究显示，HBV的变异与HBV P蛋白YMDD基因序列突变有关[10]。

本文研究发现，与未变异组相比，病毒变异组的病情分布差异有统计学意义。变异组患者的肝功能指标，如AST、ALT、ALB和TBIL的表达水平显著升高。ALT和AST主要存在于肝细胞线粒体中，是肝脏损伤的重要血清标志物。变异组升高更加明显，其原因可能与YMDD变异后，治疗药物对变异的HBV失去原有的治疗作用有关，从而使变异株病毒滴度升高，更多的病毒颗粒作用于肝细胞，肝细胞病理状态进一步恶化，病情加重[11]。同时，本文研究还发现，病毒变异组患者HBsAg表达阳性率显著低于无变异组。HBsAg是HBV病毒复制过程中产生的重要病毒蛋白，其在病毒对宿主的黏附及HBV持续感染和发病机制方面均有重要作用[12]。研究表明，HBsAg是机体特异性细胞毒性T淋巴细胞攻击的主要靶抗原，其在肝组织内的表达水平，反应HBV患者机体免疫水平和HBV复制之间的平衡，临床上通常把HBsAg的表达作为HBV复制的重要标志，能反映肝脏的炎症活动度和纤维化程度，而非活动性病毒复制阶段多表现为阴性[13]。研究表明，机体免疫应答增强并启动对HBV清除，继而攻击并大量破坏被HBV感染的肝细胞，肝组织发生纤维化及坏死等，正常肝细胞不断减少，肝细胞内HBV病毒颗粒不断减少，导致HBsAg水平不断降低[14]。研究发现，肝细胞内HBsAg的表达形式有胞桨型、胞核型、浆核型3种，其表达方式与HBV感染的不同时期有关[15]。慢性HBV感染的自然史分为免疫耐受期、免疫清除期、非活动携带状态机再活动期4个阶段[16]。早期免疫耐受期HBsAg在肝细胞内的表达以核型为主，此时肝脏很少或没有炎症活动，多见于儿童和青年人；而在免疫清除阶段，HBsAg在肝细胞内的表达以桨型和/或浆核型为主，多见于活动型肝炎患者[17]。本文研究显示，变异组的HBsAg表达形式主要是浆核型，约占阳性表达患者的47.25%，而无变异组的HBsAg表达方式主要以核型为主，约占阳性表达患者的46.15%，两组HBsAg表达方式差异有统计学意义。

本文研究结果提示，HBV聚合酶YMDD变异的乙肝患者临床病情更重，HBV表面抗原阳性表达比例低。

致谢：感谢我院、感染科的相关医护人员及入院患者对本研究的支持。