传统发酵豆制品中纳豆激酶产生菌的筛选及发酵培养基的优化

满丽莉,向殿军

(1.内蒙古民族大学 生命科学学院，内蒙古 通辽 028042；2.内蒙古民族大学 农学院， 内蒙古 通辽 028042)

血栓会导致心肌梗死、肺栓塞等疾病，近年来发病率和死亡率显著上升，但目前常用的纤溶药物具有作用时间短、价格高、来源受限、有出血风险等缺陷，开发新的纤溶药物已成为亟待解决的问题[1,2]。纳豆激酶具有安全、易吸收、作用时间长、不易导致出血倾向、成本低廉和来源广泛等众多优点，作为一种新型的溶血栓药物备受关注[3-6]。中国传统调味品是产纳豆激酶菌株的良好来源，菌株的筛选是提高纳豆激酶合成量的基础和前提条件，有利于其工业化应用，发酵培养基组成是影响纳豆激酶合成量的主要因素之一[7]。大规模发酵的不确定性通常是由于对变量交互作用缺乏了解所导致的，响应面法可在相对少的试验次数和较低的成本下研究各因素对纳豆激酶合成的影响及变量间的交互作用，通过数学模型的构建准确描述整个过程[8]。本研究从传统发酵豆制品中筛选并鉴定1株纳豆激酶高产菌株，通过单因素试验及响应面法探讨各因素之间的交互作用，确定最佳产酶培养基组成。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品

供试样品为自然发酵纳豆、市售的豆豉及纳豆。

1.1.2 试剂及培养基

试剂：凝血酶，购自中国药品生物制品检定所；纤维蛋白原和琼脂糖，购自美国Sigma公司；其他药品，均为国产分析纯。

基础种子培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2～7.4。

基础发酵培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2～7.4。

脱脂牛乳平板：5 g脱脂乳粉及1.5 g琼脂分别溶于50 mL蒸馏水后分开灭菌，冷却至50 ℃时混匀倒平板。

1.1.3 主要仪器设备

SW-CT型超净工作台 郑州南北仪器设备有限公司；MJ-54A/MJ-78A型STIK灭菌锅 北京天赐科仪商贸有限公司；BPH-9082型电热恒温培养箱 济南来宝医疗器械有限公司；Microfuge 16型离心机 美国贝克曼公司；WS-600型恒温振荡培养箱 德国Wiggens公司；110-801型三量ip67防水原点数显卡尺不锈钢零点电子游标尺 东莞市景有模具五金有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养及发酵方法

培养方法：挑取菌株接种于装有50 mL基础种子培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃，180 r/min条件下震荡培养12 h(OD600=1.5～1.6)。

发酵方法：将菌液按5%接种于装有50 mL基础发酵培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃，180 r/min条件下震荡培养72 h后，发酵液以5000×g离心10 min后，取10 μL上清液用于纳豆激酶活性的测定。

1.2.2 纳豆激酶活力的测定

纳豆激酶活力的测定采用纤维蛋白平板法[9]。溶圈直径采用电子游标尺测定。

1.2.3 纳豆激酶产生菌的筛选及鉴定

1.2.3.1 菌株的筛选

用10 mL无菌生理盐水洗涤5～7粒纳豆或豆豉，将洗涤液分装于离心管中，5000×g，10 min离心后收集菌体，制备菌悬液，95 ℃水浴处理5 min，用无菌生理盐水10倍梯度稀释菌悬液，取10-3，10-4，10-53个梯度分别吸取100 μL涂布于脱脂牛乳平板，37 ℃培养20 h，选择透明圈直径与菌落直径比值大的菌落挑菌，经反复纯化后保藏。挑取菌株按1.2.1方法培养发酵测定纳豆激酶活性，筛选出溶圈直径最大的菌株进行鉴定及发酵培养基优化。

1.2.3.2 菌株的鉴定

1.2.4 纳豆激酶发酵培养基的优化

1.2.4.1 碳源种类及浓度对纳豆激酶合成的影响

运用1%、2%、3%、4%的蔗糖、玉米淀粉、麸皮、可溶性淀粉分别代替基础发酵培养基中2%的葡萄糖，其他成分不变，以基础发酵培养基为对照。温度37 ℃，转速180 r/min，振荡培养72 h，测定溶圈直径，选取适宜的碳源种类及其浓度。

1.2.4.2 氮源种类及浓度对纳豆激酶合成的影响

运用1%、2%、3%、4%的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕粉、硫酸铵分别代替基础发酵培养基中2%的蛋白胨，其他成分不变，以基础发酵培养基为对照。温度37 ℃，转速180 r/min，振荡培养72 h，测定溶圈直径，选取适宜的氮源种类及其浓度。

1.2.4.3 无机盐种类及浓度对纳豆激酶合成的影响

通用电气公司把企业文化视为最好的精神黏合剂，把公司所有人紧紧团结在一起，向着共同的愿景目标，协调一致，努力奋斗，从而把通用电气打造成一个年轻而有活力的企业。韦尔奇告诫大家：“人才即是一切，有人才的公司才能成为最大的赢家。”“投资于人才”是通用电气公司核心的管理文化——人才是企业的核心力量，优秀人才是公司最重要的战略资源，是企业价值的主要创造者。在人才全球化战略的指引下，全球范围内寻找最优秀的人才，挖掘有潜力的人才，留住一流的人才，挑选好接班人，始终是通用电气公司最重要的战略规划。通用电气公司的每一个企业都重用当地人才，同时注重培养其全球化工作能力，实现了人才的“全球本土化和本土全球化”。

采用不同浓度的K2HPO4∶KH2PO4(0.1%∶0.1%、0.2%∶0.1%、0.6%∶0.1%)、MnSO4·H2O(10-5，10-4，10-3mol/L)、CaCl2(0.02%、0.04%、0.06%)、MgSO4(0.02%、0.04%、0.06%)分别代替基础发酵培养基中0.5%的NaCl，其他成分不变，以基础发酵培养基为对照。温度37 ℃，转速180 r/min，振荡培养72 h，测定溶圈直径，选取适宜的无机盐种类及其浓度。

1.2.4.4 表面活性剂种类及浓度对纳豆激酶合成的影响

运用0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的吐温40、吐温80、羧甲基纤维素、聚乙二醇分别添加到基础发酵培养基中，其他成分不变，以基础发酵培养基为对照。温度37 ℃，转速180 r/min，振荡培养72 h，测定溶圈直径，选取适宜的表面活性剂种类及其浓度。

1.2.4.5 响应面法优化纳豆激酶发酵培养基

应用Design-Expert软件中的Box-Benhnken设计构建模型，响应面法寻找最佳发酵培养基。以可溶性淀粉(A)、大豆蛋白胨(B)、氯化钙(C)、硫酸镁(D)、羧甲基纤维素(E)5个因素为自变量，溶圈直径(mm)为响应值，运用五因素三水平的响应面分析试验，共46个试验点，其中40个为析因子，6个为中心试验。试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test %

1.2.5 数据分析

应用SPSS 17.0软件中的One-Way Analysis of Variance(ANOVA)计算标准差。采用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Benhnken设计进行响应面数据分析。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选

运用脱脂牛乳平板法从自然发酵纳豆、市售的纳豆及豆豉中初筛出60株蛋白酶产生菌株，采用纤维蛋白平板法从豆豉中复筛出1株纳豆激酶活性显著较高的菌株(P<0.01)，命名为菌株MX-6，溶圈直径高达(21.60±0.48) mm。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌落形态及菌体形态

图1 菌株MX-6的菌落形态(a)及菌体形态(b)Fig.1 Colony morphology (a) and bacterial morphology (b) of strain MX-6

菌株MX-6的菌落呈白色，不规则圆形，边缘呈波状，有褶皱，中央凸起，不透明，无光泽(见图1a)。显微镜观察结果显示菌株MX-6为革兰氏染色阳性，菌体呈杆状，两端钝圆，以单个或短链状存在，芽孢为椭圆形，偏端生，芽孢囊无明显膨大(见图1b)。

2.2.2 生理生化鉴定

表2 菌株MX-6的生理生化鉴定Table 2 Physiological and biochemical identification of strain MX-6

由表2可知，菌株MX-6具有枯草芽孢杆菌属的典型特征。

2.2.3 菌株MX-6的16S rDNA基因扩增及同源性分析

图2 菌株MX-6的DNA(a)及16S rDNA基因(b)Fig.2 DNA (a) and 16S rDNA gene (b) of strain MX-6

以菌株MX-6的总基因组DNA为模板(见图2a)，应用简并引物扩增16S rDNA基因片段，获得的序列片段长度为1542 bp(见图2b)，其序列与GenBank中已公布的枯草芽孢杆菌168(NR102783.1)的16S rDNA基因序列同源性高达99%以上，证明菌株MX-6为枯草芽孢杆菌。

2.3 不同碳源及浓度对纳豆激酶活力的影响

表3 碳源对枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶的影响Table 3 Effect of carbon source on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表3可知，蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉及2%的麸皮作为碳源均能显著提高纳豆激酶的合成量(P<0.01)，3%的可溶性淀粉作为碳源时，纳豆激酶产量最高，溶圈直径最大为，29.94 mm。

2.4 不同氮源及浓度对纳豆激酶活力的影响

表4 氮源对枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶的影响Table 4 Effect of nitrogen source on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表4可知，胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕粉作为氮源均能显著提高纳豆激酶的合成量(P<0.01)，而硫酸铵作为氮源会降低纳豆激酶的合成量(P<0.01)，2%的大豆蛋白胨作为氮源时，纳豆激酶产量最高，溶圈直径最大，为31.06 mm。

2.5 不同无机盐及浓度对纳豆激酶活力的影响

表5 无机盐对枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶的影响Table 5 Effect of inorganic salt on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表5可知，MnSO4·H2O会显著抑制纳豆激酶的合成(P<0.01)，K2HPO4和KH2PO4对纳豆激酶合成的影响不大(P>0.05)，而MgSO4和CaCl2有利于提高纳豆激酶合成量(P<0.01)，两者的添加量为0.04%时，溶圈直径分别达到26.21 mm和26.82 mm。

2.6 不同表面活性剂及浓度对纳豆激酶活力的影响

表6 表面活性剂对枯草芽孢杆菌 MX-6产纳豆激酶的影响Table 6 Effect of surfactants on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表6可知，吐温40、吐温80、羧甲基纤维素和聚乙二醇有利于纳豆激酶的合成(P<0.01)，添加0.4%的羧甲基纤维素时，纳豆激酶产量最高，溶圈直径最大，为29.13 mm。

2.7 响应面法优化纳豆激酶发酵培养基

2.7.1 模型建立及显著性分析

以溶圈直径为响应值，运用Box-Benhnken设计46组实验(见表7)。二次回归模型为：Y=-115.47771+14.91187A+9.75708B+1960.04167C+2093.20833D+196.8604-0.042500AB-26.25000AC-33.75000AD-0.25000AE+1.00000BC-22.75000BD-0.45000BE-2025.00000CD-50.00000CE-292.50000DE-2.12292A2-2.24208B2-22720.83333C2-22354.16667D2-231.95833E2。

式中：Y为抑菌圈直径的预测值，A为可溶性淀粉的编码值，B为大豆蛋白胨的编码值，C为氯化钙的编码值，D为硫酸镁的编码值，E为羧甲基纤维素的编码值。

表7 Box-Benhnken试验设计及结果Table 7 Design and results of Box-Benhnken experiment

续 表

表8 二次模型的方差分析Table 8 Analysis of variance (ANOVA) for the quadratic model

注：“*”表示显著(P<0.05)，“**”表示极显著(P<0.01)；“-”表示不显著。

由表8可知，该模型的P<0.01，表明试验所采取的二次模型极显著。失拟项的P=0.1004>0.05，模型失拟项不显著，决定系数R2=0.9925，表明模型与实际情况拟合度较高，所以可应用该模型对试验结果进行预测和分析。该模型中A、B、C、D、E、AD、DE、A2、B2、C2、D2、E2的P<0.01，表明可溶性淀粉、大豆蛋白胨、氯化钙、硫酸镁、羧甲基纤维素、可溶性淀粉和硫酸镁的交互作用、硫酸镁和羧甲基纤维素的交互作用、可溶性淀粉的平方、大豆蛋白胨的平方、氯化钙的平方、硫酸镁的平方、羧甲基纤维素的平方对纳豆激酶合成量的影响极显著。AC、BD、CD的P<0.05，表明可溶性淀粉和氯化钙、大豆蛋白胨和硫酸镁、氯化钙和硫酸镁的交互作用对纳豆激酶合成量的影响显著。交互项AB、AE、BC、BE、CE的P>0.05，表明可溶性淀粉和大豆蛋白胨、可溶性淀粉和羧甲基纤维素、大豆蛋白胨和氯化钙、大豆蛋白胨和羧甲基纤维素、氯化钙和羧甲基纤维素的交互作用对纳豆激酶合成量无显著性影响。

2.7.2 响应面分析

各因素的变化范围分别为可溶性淀粉2%～4%，大豆蛋白胨1%～3%，氯化钙0.03%～0.05%，硫酸镁0.03%～0.05%，羧甲基纤维素0.30%～0.50%。在分别分析两个因素之间的交互作用时，其中一个因素固定，随着另一个因素浓度的增加，纳豆激酶的合成量均呈现先增加后减少的趋势(见图3)，说明各因素的最佳浓度在选定的范围内。优化发酵培养基为可溶性淀粉2.91%、大豆蛋白胨1.92%、氯化钙0.04%、硫酸镁0.04%、羧甲基纤维素0.39%。预测的溶圈直径为33.84 mm。

图3 两两因素之间的响应面图Fig.3 Response surface graphs between two factors

2.7.3 回归模型的验证试验

为检验预测结果的可靠性，采用优化培养基进行验证试验。实际溶圈直径为(33.87±0.12) mm，与预测的溶圈直径33.84 mm相比较差异不显著(P>0.05)，表明该模型可靠性好。与优化前的溶圈直径(21.60±0.48) mm 相比较，溶圈直径提高了56.81%，可见该模型能较好地预测纳豆激酶的合成情况。

3 结论

由于纳豆激酶的溶栓效果远远大于弹性蛋白酶和纤溶酶，具有生产周期短、成本低、产量高等优点，使其成为研究热点[9,10]。从中国豆豉中筛选获得1株纳豆激酶高产菌株MX-6，经菌落形态、菌体形态和16S rDNA基因同源性分析鉴定为枯草芽孢杆菌，该菌株来源于中国传统调味品，是农业部和FDA认定的安全性菌株，可用于研究其液体发酵合成纳豆激酶，进行溶栓药物开发。提高纳豆激酶合成量的主要途径包括：筛选纳豆激酶高产菌株；物理或化学诱变选育；优化发酵条件或培养基。由于枯草芽孢杆菌在非适宜营养条件下极易形成休眠体——芽孢，导致产酶终止，所以优化培养基组成是显著提高纳豆激酶合成量的有效途径之一[11,12]。本研究应用响应面法对枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶的发酵培养基进行优化，获得的最佳发酵培养基为：可溶性淀粉2.91%、大豆蛋白胨1.92%、氯化钙0.04%、硫酸镁0.04%、羧甲基纤维素0.39%。在该发酵培养基中所产纳豆激酶的溶圈直径可高达33.87 mm，与响应面预测值相比差异不显著，表明响应面模型的可行性和可靠性，所以本试验优化获得的最佳产酶培养基切实可行，可为纳豆激酶的工业化生产奠定基础。