青果多糖组分对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用研究*

刘 梅，王 颖，王耀登，刘 洪，王 琴

（重庆市中医院，重庆 400021）

癌症是严重危害人类健康的恶性疾病，根据2017年国家癌症中心发布的中国最新癌症报告，中国每年新发癌症病例429万，即全国每天约1万人确诊癌症，每1分钟约7人确诊患癌。癌症已成为严重影响国民身体健康和社会发展的重要因素，为我国的医疗系统带来了巨大压力[1]。目前，临床预防和治疗恶性肿瘤主要以化学治疗为主，顺铂和5-氟尿嘧啶等是常用药物，但因毒副作用较大而限制了使用，故开发研制新型有效、副作用低的抗肿瘤药物成为科研工作者关注的重点。多糖是一类由多羟基醛或多羟基酮通过糖苷键连接而成的天然高分子聚合物，具有多种天然活性，如调节免疫、降血糖、抗肿瘤[2-3]等作用。青果Canarii Fructus为橄榄科植物橄榄Canarium album（Lour.）Raeusch.的干燥成熟果实，味甘、酸，性平，具有清热解毒、利咽、生津的功效。现代药理学研究表明，青果具有抗炎[4]、镇痛[5]、抗氧化[6]及抑制肿瘤细胞增殖[7]的作用。本研究中提取分离青果中的多糖类成分，并对其部位多糖和蛋白多糖类成分抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖作用进行研究。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试药与仪器

细胞：人宫颈癌Hela细胞株[美国菌种保藏中心（ATCC），批号为 bc1043]。

药材：青果（四川欣康中药饮片有限公司，批号为170401），经重庆市中医院药剂科药检室王琴副主任中药师鉴定为正品。

仪器：Synergy HT型全自动酶标仪（美国Biotek公司）；BSA124S型电子分析天平（德国 Sartorius公司）；TDA-8002型电热恒温水浴锅（上海精宏设备有限公司）；DHG-9053A型电热鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）。

试药：DMEM高糖培养基、胎牛血清、1%青-链霉素、0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司）；四氮唑盐（MTT）试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）；DEAE-琼脂糖凝胶FF（中国北京瑞达恒辉科技发展有限公司）；3 500 Da透析袋（中国上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇、氯化钠（重庆川东化工集团有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 青果粗多糖的制备及含量测定

提取流程：取青果饮片，粉碎，加8倍量无水乙醇，加热回流提取4 h，滤过；药渣置电热鼓风干燥箱中，40℃烘干，加8倍量水煎煮3次，合并水煎液，滤过，去残渣；减压浓缩至浓稠液，加4倍量无水乙醇使醇体积分数达80%，静置过夜，去上清液，收集沉淀，挥干，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，挥干，加水溶解，冷冻干燥，即得青果粗多糖。

DEAE-琼脂糖凝胶FF预处理：以0.2 mol／L氢氧化钠溶液清洗DEAE-琼脂糖凝胶FF至无色，以蒸馏水洗至中性，再以0.1 mol／L盐酸溶液清洗至无色，以蒸馏水洗至中性，蒸馏水配置成匀浆，减压脱气1 h，直至浆液无任何气泡，装柱（35 mm×30 cm），蒸馏水平衡过夜。

青果粗多糖各部位分离：称取约5 g青果粗多糖，溶于20 mL蒸馏水，4 000×g离心5 min，取上清液，玻璃棒引导，沿色谱柱壁缓缓加样，依次以蒸馏水、0.5mol／L 氯化钠溶液、1.0mol／L 氯化钠溶液、2.0mol／L氯化钠溶液洗脱，采用苯酚-硫酸法检测洗脱液含糖部分，收集，透析袋用自来水流水透析24 h，减压浓缩，冷冻干燥，得青果粗多糖各部位，即 CFW，CF1，CF2，CF3。

总多糖含量测定：称取D-葡萄糖对照品20 mg，精密称定，置250 mL容量瓶中，加去离子水定容，分别量取 0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，置 2 mL容量瓶中，加去离子水定容，加6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置20 min；于 490 nm波长处测定吸光度，以去离子水为空白对照，得标准曲线。吸取待测溶液适量，按上述步骤操作，根据标准曲线计算总多糖含量。

总蛋白含量测定：以BCA蛋白定量法测定，配制工作液，并配制1 g／L待测溶液。根据微孔板方案（样品与工作液的比例为1∶8），取3组样品，按标准曲线法操作，取平均值，根据标准曲线计算总蛋白含量。

1.2.2 细胞试验

细胞培养：置Hela细胞于含10%胎牛血清和1%青-链霉素的高糖DMEM培养液中，于37℃及5%CO2细胞培养箱内培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。

药液制备：分别称取 CFW，CF1，CF2，CF3 约 2 mg，精密称定，置灭菌EP管中，加入含10%胎牛血清和1%青-链霉素的高糖DMEM培养液，使质量浓度为1 000 μg／mL，振摇混匀，4 000×g离心 5 min，取上清液，经0.22 μm无菌滤头滤过除菌，倍比稀释，得质量浓度均为 62.5，125，250，500 μg／mL 的 CFW，CF1，CF2，CF3溶液。

细胞增殖抑制试验：采用MTT法，选取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶进行消化，重悬，调整细胞密度约为 5×104个／mL，以每孔 100 μL接种于 96孔板中；于37℃及5%CO2细胞培养箱内培养24 h，待细胞贴壁后，弃去上清液，加入 200 μL不同质量浓度的CFW，CF1，CF2，CF3溶液，每组设置 3个复孔；同时以不含多糖的细胞培养液为空白对照；于37℃及5%CO2细胞培养箱内培养 48 h后，每孔加 20 μL MTT溶液（25 mg MTT溶于5 mL MTT溶液中），细胞培养箱中静置培养 4 h，弃去培养液，每孔加 150 μL Formazan溶解液，摇床上振摇15min，于37℃下、570nm波长处，以酶标仪测定每孔吸光度（A）。抑制率（%）=（1-A试验／A对照）×100%。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 青果多糖的总糖和总蛋白含量

青果粗多糖得率为7.11%，性状为淡黄色粉末。CFW，CF1，CF2，CF3 得率分别为 36.8% ，25.5% ，14.1% ，13.7% ，总回收率为 90.1% ，性状均为白色粉末状。结果见表1。

表1 青果粗多糖总糖和总蛋白含量（±s，% ，n=3）

表1 青果粗多糖总糖和总蛋白含量（±s，% ，n=3）

成分 总糖 总蛋白C F W C F 1 C F 2 C F 3 8 0.4 3 ±1.9 9 7 6.3 8 ±1.0 3 7 0.9 0 ±0.5 3 7 2.5 4 ±1.1 2 1 4.5 9 ±0.1 9 3.3 7 ±0.2 3 1.5 6 ±0.1 3 0.8 7 ±0.0 9

2.2 Hela细胞增殖抑制效果

与空白对照比较，62.5，125，250，500，1 000 μg ／mL CFW，500 μg／mL 和 1 000 μg／mL CF1 及 1 000 μg／mL CF2和 CF3的A显著降低（P＜0.05或P＜0.01），表明以上质量浓度组分对Hela细胞增殖有抑制作用。结果见表2。

表2 CFW，CF1，CF2，CF3对Hela细胞增殖的抑制作用（±s，n=3）

表2 CFW，CF1，CF2，CF3对Hela细胞增殖的抑制作用（±s，n=3）

注：与空白对照比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01。A570指 570 nm 波长处的吸光度。

质量浓度（μg／mL）空白对照组别CFW CF1 CF2 CF3 A570抑制率（%）0 17.1 ± 5.2 30.5 ±4.4 43.5 ±3.9 50.8 ± 2.3 57.6 ± 3.1 A570 A570抑制率（%）0 0.1 ± 7.8 1.5 ±5.0 8.0 ±5.3 12.1 ± 5.7 13.4 ± 6.5抑制率（%）0 4.6 ± 3.2 8.2 ±4.8 11.3 ±5.1 16.9 ± 4.5 22.4 ± 3.9 A570 0 CFW 62.5 125 250 500 1 000 0.959 ± 0.075 0.795 ± 0.050△0.667 ± 0.042△0.542 ± 0.038△0.471 ± 0.022△0.406 ± 0.030△0.959 ± 0.075 0.915 ± 0.030 0.880 ±0.046 0.850 ±0.049 0.797 ± 0.044△0.744 ± 0.038△0.959 ± 0.075 0.945 ± 0.048 0.882 ±0.051 0.843 ±0.055 0.830 ± 0.062 0.785 ± 0.057*0.959 ± 0.075 0.943 ± 0.039 0.912 ± 0.026 0.860 ± 0.042 0.850 ± 0.046 0.775 ± 0.039△抑制率（%）0 1.7 ± 4.0 4.9 ±2.8 10.3 ±4.4 11.4 ± 4.8 19.2 ±4.1

3 讨论

本试验中利用乙醇除脂、水提、醇沉的方法从青果中提取得到粗多糖和粗多糖复合物成分，进一步利用DEAE-琼脂糖凝胶FF离子交换色谱对提取得到的粗多糖和粗多糖复合物成分进行部位分离，得到CFW，CF1，CF2，CF3 4个部位，通过总多糖和总蛋白含量测定，得 CFW 为含有（80.43±1.99）%总多糖和（14.59±0.19）%总蛋白的蛋白多糖类，而 CF1，CF2，CF3 为含有极少量蛋白的多糖类成分。

MTT法是一种检测细胞增殖和存活的方法，原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，以酶标仪测定A，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数呈正相关。

本试验中采用MTT法检测CFW，CF1，CF2，CF3这4个组分抑制人宫颈癌Hela细胞增殖的作用，结果显示，CFW 在 62.5，125，250，500，1 000 μg ／mL 质量浓度下均可显著抑制Hela细胞增殖，1 000 μg／mL质量浓度下的抑制率达（57.6 ±3.1）%，CF1，CF2，CF3 在高质量浓度条件下也可显著抑制Hela细胞的增殖，但抑制活性较弱。

近年来，具有抗肿瘤活性的多糖类和糖蛋白类成分不断被发现，如绞股蓝多糖GPP2可显著抑制人肝癌HepG2细胞和人宫颈癌Hela细胞的增殖[8]，蛤蚧糖蛋白GSPP可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖[9]，鲍鱼菇糖蛋白LB-1b可显著抑制人肝癌HepG2细胞和人乳腺癌MCF7细胞的增殖[10]。本试验在体外试验中发现，青果中CFW组分具有显著抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖作用，为青果开发为抗肿瘤药物提供了前期的理论基础。