肠内营养对缺血性脑卒中患者肠道菌群的影响

范春江，刘庭玉，李刚，黄建，曹扬，党旖旎

1.无锡市康复医院（无锡市残疾人康复中心）康复科，江苏无锡市214043；2.复旦大学附属中山医院青浦分院消化内科，上海市201799；3.南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）消化内科，江苏南京市210029

缺血性脑卒中是指由于脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起局限性脑组织缺血、坏死或脑软化，具有发病率高、死亡率高、复发率高及致残率高等特点[1]。我国脑卒中亚型中，近70%为缺血性脑卒中[2]。康复治疗在缺血性脑卒中综合治疗中起着重要作用，对改善患者神经和肢体运动功能，提高生活质量起到积极作用。

消化康复是康复治疗中的重要组成部分，经过严格规范的营养治疗可以达到改善卒中患者预后的目的[3]。肠道微生态(gut microbiota)是肠道微生物与其宿主在进化过程中共同形成的统一体，与人类的健康息息相关。随着人体肠道微生物群落基因组研究的不断深入，越来越多的分子生物学证据揭示，肠道微生物群落不仅参与和调控机体的生理功能，还通过肠-脑轴影响缺血性脑卒中的预后[4]。

本研究旨在探讨肠内营养是否可促进恢复期缺血性脑卒中的康复及其可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月20日至4月22日在无锡市残疾人康复中心住院治疗的恢复期缺血性脑卒中患者，符合1995年第四届全国脑血管病会议制定的诊断标准，经头颅CT或MRⅠ证实为缺血性脑卒中。

纳入标准：①Fujishima评分[5]为1～6分；②能够配合治疗；③签署知情同意书。

排除标准：①短暂性脑缺血发作；②蛛网膜下腔出血；③并发严重的内分泌和代谢性疾病；③并发严重的肝肾功能障碍；⑤并发慢性心肺功能不全；⑥并发消化道应激性溃疡；⑦并发血液系统疾病；⑧并发恶性肿瘤；⑨接受溶栓治疗；⑩入组前3个月内服用过益生菌制剂。

共121例患者入组，其中男性43例，女性78例，平均年龄为(79.6±9.43)岁；并发症中以高血压居多；卒中类型以TOAST分型Ⅲ型(小动脉闭塞性卒中或腔隙性卒中)为主(75.2%)，另有30例Ⅰ型(大动脉粥样硬化性卒中)。见表1。

本研究经医院伦理委员会审核批准(No.KFYYLL-001)。

表1 患者一般资料(n=121)

1.2 方法

1.2.1 常规治疗

所有入组患者均予抗血小板凝集、抗凝及他汀类药物治疗。康复训练包括偏瘫肢体综合训练、运动治疗、作业治疗、吞咽功能训练、中频脉冲电治疗和红外线治疗等。观察期间持续治疗。

1.2.2 肠内营养方案

取肠内营养混悬液(TPF，能全力，纽迪希亚制药有限公司，批号H20010284)，以及由本院营养师依据患者体质量、营养状况和病情配置高能营养液，热量按每天83.68～125.52 kJ/kg提供。由专职护士负责，通过鼻饲管静滴，滴速40～60 ml/h，若无腹泻、腹胀、反流等不良反应，则持续注入。每天2次，每次500 ml。每3～4小时检查胃潴留量，若大于150 ml，暂停肠内营养2～4 h。治疗1周。

1.2.3 营养状况评定

采用营养风险筛查表(Nutrition Risk Screening,NRS2002)对所有患者于入院时、干预后1周和1个月时分别进行营养状况评定，同时检测患者血浆蛋白和肝肾功能等指标。

1.2.4 肠道菌群检测

嘱患者在入院时、干预后1周和1个月时留取新鲜粪便标本约10 g。分离、提取、纯化和检测总DNA，行16SrDNA可变区PCR扩增和测序，最后进行菌种鉴定和生物信息学分析。

生物信息学分析包括：①数据统计，通过Ⅰllumina平台(HiSeq或者MiSeq)进行Paired-end测序，下机数据经过去除低质量reads，每个样本获得Clean Data；②序列拼接，使用软件FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads,v1.2.11)，利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列，得到高变区的Tags；③物种分类和丰度分析，将经过上述处理的Clean Tags进行OTU聚类，然后通过对OTU注释完成OTU的物种分类，并进行OTU及其丰度分析。

物种及其丰度分析采用observed species指数、chao指数和ace指数。它们反映患者肠道菌群中群落的丰度(species richness)，即简单指群落中物种的数量，而不考虑群落中每个物种的丰度情况。指数越高，说明标本中的物种越丰度。

多样性分析采用Shannon指数和Simpson指数。它们反映群落的多样性(species diversity)。受样品群落中物种丰度(species richness)和物种均匀度(species evenness)的影响，在相同物种丰度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性。Shannon指数越高，说明标本中物种多样性越大，Simpson指数越小说明标本中的物种多样性越大。

1.2.5 炎症因子检测

采用酶联免疫吸附试验检测炎症因子。

嘱患者在入院时、干预后1周和1个月时留取外周血，分离血清，冻存于-80℃待用。严格按照试剂盒(R&D公司)说明书进行操作，测量吸光度值，使用相关软件绘制标准曲线，并计算血清样本中肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,ⅠL)-1α、ⅠL-1β、ⅠL-6和ⅠL-8的含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 营养状况

入院时患者营养风险评分为(3.4±1.26)分，血浆总蛋白和白蛋白分别为(66.13±5.21)g/L和(31.98±4.23)g/L。

干预后1周时营养风险评分为(3.3±1.38)分，与入院时相比接近，差异无统计学意义；血浆总蛋白和白蛋白分别为(67.89±6.52)g/L和(33.15±5.37)g/L，与入院时相比无明显增高(P＞0.05)。

干预后1个月时营养风险评分为(2.9±1.69)分，与入院时相比下降(P＜0.05)；血浆总蛋白和白蛋白分别为(71.94±4.91)g/L和(36.86±3.59)g/L，与入院时相比增高(P＜0.05)。

2.2 肠道菌群

选取10例患者进行16SrDNA基因序列分析，以检测肠道菌群。

2.2.1 肠道菌群OTU个数

在97%相似度下，得到每个样品的OTU个数。OTU Venn图可以显示干预前后共有OTU数目以及各自特有OTU数目。入院时、干预后1周和1个月时患者OTU数目分别为599、1177和566。患者入院时与1周时共有518个OTU，入院时与1个月时共有503个OTU，1周与1个月时共有510个OTU，而三组共有的OTU数目为465。见图1。

图1 肠内营养治疗前后肠道菌群OTU Venn图分析

2.2.2 肠道菌群物种

通过与数据库比对，分别在门水平和种水平对OTU物种样品做物种profiling面积图和柱状图。见图2。

在门水平，干预前优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，共占细菌门类90%以上；干预后1周优势菌门为拟杆菌门、变形菌门、疣微菌门(Verrucomicrobia)和厚壁菌门，共占细菌门类95%以上；干预后1个月优势菌门为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，共占细菌门类85%以上。

在种水平，大部分均为未分类菌种，其余菌种在干预前的优势菌种为单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)等；干预后1周的优势菌种为单形拟杆菌、大肠杆菌、卵形拟杆菌、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)和艾克曼菌等；干预后1个月的优势菌种为脆弱拟杆菌、单形拟杆菌和艾克曼菌等。

2.2.3 肠道菌群多样性

Alpha多样性分析显示，干预后1周时ace指数增高(P＜0.05)；1个月时observed species指数、chao指数和干预后指数较1周时降低，但仍高于入院时的数值；Shannon指数随着干预时间逐渐增高，但无显著性差异；Simpson指数在1周时最低(P＜0.05)。见图3。

图2 肠内营养治疗前后肠道菌群物种分析

2.3 炎症因子

干预后1周时与入院时相比，ⅠL-1β增高(P＜0.05)，血清ⅠL-8逐渐下降(P＜0.05)；其他无显著性差异(P ＞ 0.05)。1个月时与入院时相比，ⅠL-1β和ⅠL-6增高(P ＜ 0.05)，血清ⅠL-8逐渐下降(P ＜ 0.05)；ⅠL-1α和TNF-α无显著性差异(P＞0.05)。见图4。

3 讨论

《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》[6]中指出，脑卒中后呕吐和吞咽困难可引起脱水和营养不良，导致神经功能恢复减慢。应重视脑卒中后液体和营养状况评估，必要时给予补液和营养支持。《2005年美国急性缺血性卒中早期治疗指南》[7]中同样推荐，对住院脑卒中患者应进行营养基线评定，并采取措施纠正或改善营养障碍。

本研究结果显示，肠内营养治疗可能通过改变肠道微生态，调控炎症因子水平，可能有利于促进缺血性脑卒中患者的预后。

脑卒中后营养干预管理在我国脑卒中规范化康复中应该引起重视。本研究发现，经过肠内干预后1个月时，营养风险评分下降，血浆总蛋白和白蛋白增高。

Beamer等[8]的研究显示，脑卒中患者应在入院后48 h内进行营养状况筛查，任何患者存在营养不良或者进食困难时都应给予营养治疗，可有利于神经功能恢复。患者家属喂养饮食内容随意，无法根据患者营养状况及时供给，造成营养状况持续恶化，可能会导致病情加重。

图3 肠内营养治疗前后肠道菌群Alpha多样性分析

图4 营养治疗前后血清炎症因子的变化

本研究还发现，实施营养治疗1周时，少数患者营养状况有小幅度下降，提示肠内营养可能并未完全达到营养需求目标。Dávalos等[9]同样发现，在缺血性脑卒中患者中，早期营养治疗1周后，发现其营养状况并未明显改善。可能与脑卒中引起脑干和下丘脑功能紊乱，造成神经内分泌异常，以及肠黏膜屏障损害造成肠道吸收功能下降，导致营养摄入障碍等有关。这需要在以后的研究中进一步探索。

采用16SrDNA基因序列分析检测肠道菌群后发现，不同干预时间点OTU个数有变化，且从门水平和种水平上，菌群都有变化。

本研究结果显示，干预1周时ace指数增高；1个月后observed species指数、chao指数和ace指数较1周时降低，但仍高于入院时数值，提示干预前后肠道菌群丰度存在差异；Shannon指数随着干预时间逐渐增高，但差异无统计学意义；Simpson指数1周时最低，提示干预前后肠道菌群多样性存在差异，说明肠内营养治疗可改变菌群的多样性。也就是说，消化康复干预可以改变缺血性脑卒中患者肠道菌群的组成。Claesson等[10]同样发现营养治疗可以改变肠道菌群丰度。

而Goyal等[11]发现，肠道菌群多样性和丰度不仅受饮食影响，还受年龄、性别、自身状况、炎症标志物、粪便中代谢产物等多种因素影响。

Singh等[12]发现，在诱导的缺血性脑卒中动物模型中，肠道菌群可以通过调节T细胞来影响炎症因子水平，从而影响脑卒中的预后。

Kostulas等[13]研究发现，缺血性脑卒中患者ⅠL-8的增高趋势，可能与ⅠL-8可趋化多形核白细胞聚集，加重脑细胞炎症有关。临床中也发现，患者血浆中ⅠL-1β和ⅠL-6有逐渐增高趋势。多项研究认为[13-15]，这种增高趋势可能加速脑细胞损伤，延迟患者神经功能恢复。

经过肠内营养治疗，本研究中患者的ⅠL-8逐渐下降。提示营养治疗可能通过免疫调节影响缺血性脑卒中的预后。

综上所述，消化康复目前尚无明确的体系和具体的方案，通过研究肠道菌群，可为之提供理论依据。

本研究还需要从以下几个方面改进：①增加更多的观察指标，如功能评定量表等，进一步研究肠道菌群干预与功能改善和预后的关系；②扩大样本量并延长随访时间；③消化康复是否需要采用肠内与肠外营养相结合的方式，肠内营养制剂的成分是否需要逐渐过渡等，仍需要进一步研究。