益经汤对卵巢功能减退模型大鼠卵巢Bcl-2、Bax 蛋白的影响※

万云慧 陶莉莉 陈晓勇

（1 江西省妇幼保健院中医科，江西 南昌 330006；2 广州中医药大学第一附属医院妇科，广东 广州 510405）

卵巢功能减退 （diminished ovarian reserve，DOR）是指女性患者40 岁以前出现卵巢功能的减退，以月经的异常改变（如月经量增多或月经量减少）、不孕为主要的临床表现［1］。近年来，DOR 的发病率越来越高，越来越年轻化，如若DOR 患者得不到及时有效的治疗，将最终进展为卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。目前关于DOR 病因尚不明确，现代医学认为可能与遗传、免疫、心理及环境因素等有关［2］。目前西医主要采取人工周期激素替代疗法，人工周期疗法虽然可以改善患者一系列的低雌激素症状，在一定程度上改善患者的生活质量，但远期的总体效果并不十分理想。长期使用，不良反应多，如出现肝肾功能的异常，增加子宫内膜癌、乳腺癌、静脉血栓的风险。近年来，随着中医药的不断发展，中药治疗DOR 取得不错的进展。本人以往的研究显示加减益经汤具有补肾健脾、疏肝活血的作用，能够改善卵巢的功能，本研究将通过观察加减益经汤对DOR 模型大鼠卵巢颗粒细胞上Bcl-2 及Bax 蛋白表达的影响，进一步探讨加减益经汤改善卵巢功能、治疗DOR 的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12 周鼠龄的清洁级成年Spragne-Dawley（SD） 雌性大鼠，体质量约为（230±10） g。由广东省中医研究提供，共60 只。

1.2 实验药物 加减益经汤：熟地黄20 g，菟丝子20 g，当归10 g，白芍10 g，丹参15 g，党参20 g，柴胡6 g 等9 味中药组成。将以上药物重复煎煮、过滤2 次，将滤液混合，然后将其浓缩为中药高剂量含生药2.36 g/mL，中药中剂量含生药1.18 g/mL，中药低剂量含生药0.59 g/mL，装瓶冷却后，低温储藏（由广东省中医研究所制备）。戊酸雌二醇片（补佳乐）：拜尔医药保健有限公司广州分公司，批号：国药准字J20130009。

1.3 动物分组方法 随机将大鼠分为空白组、模型组、中药汤高、中、低剂量组和补佳乐组。

1.4 DOR 大鼠模型的建立 空白组大鼠单次腹腔注射1 mL 0.9% 生理盐水，剩下的5 组大鼠均单次腹腔注射环磷酰胺 （CTX） 75 mg·kg-1。

1.5 给药方法 各组大鼠都以相同的标准的饲料来饲养，在腹腔注射2 h 后，当日就开始灌胃，空白组和模型组均灌胃2 mL 的0.9% 生理盐水；中药高剂量组：以23.6 g/kg 加减益经汤灌胃；中药中剂量组：以11.8 g/kg加减益经汤灌胃；中药低剂量组：以5.9 g/kg 加减益经汤灌胃；补佳乐组：以0.09 mg/kg 补佳乐灌胃，1 d 1 次，连续灌胃共4 周。

1.6 检测指标4 周灌胃结束后，处死大鼠，完整取出其卵巢组织，经福尔马林固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋切片，SP 法按试剂盒分别进行免疫组化测定Bax、Bal-2及AMH 蛋白的表达。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0 软件进行统计，计量资料用均数±标准差（x±s）表示；多组间均数的比较，方差齐时采用单因素方差分析，组间均数两两比较，采用LSD-t 检验；方差不齐时采用Kruskal Wallis H 法。两两比较采用Noparapotric Nemenyi test。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织AMH 及Bcl-2的蛋白表达降低，Bax 蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，中药高、中剂量组Bcl-2蛋白表达及AMH 升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；补佳乐组、中药高、中、低剂量组Bax 蛋白的表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 加减益经汤对DOR 模型大鼠卵巢组织AMH、Bcl-2 及Bax 的影响 （x±s）

3 讨论

加减益经汤是由益经汤加减而成，益经汤出自傅山的《傅青主女科》，其中对月经的生理高度概括为“经水出诸肾”，并明确列出“年未老经水断”“女子七七而天癸绝，有年未至七七而经水先断者……谁知是心肝脾之气郁乎”。傅山所指的“年未老经水断”应为现代的DOR、POF，并认为其病因病机是心肝脾气郁，导致肾气郁而不宣，不能盈满而溢泄。治疗大法为补肾健脾疏肝，创制益经汤，组方中熟地黄、当归、杜仲补肾养血，党参、白术、山药健脾益气，柴胡、白芍疏肝解郁，酸枣仁、牡丹皮清心，沙参补益肺气，加减益经汤在此基础上加菟丝子（增强了补肾的作用），加丹参（“一味丹参，功同四物”），去白术、山药、生枣仁、丹皮（减少了方剂药物的组成），改人参为党参。治疗大法与益经汤相似，全方配伍重在补肾健脾、疏肝活血，而兼有清养心肺的功效。临床上已表明其能改善DOR 患者低雌激素症状，改善DOR 患者的卵巢功能［3］。经现代药理学分析加减益经汤中的绝大多数药物具有调节内分泌及抗衰老的功效，在治疗DOR 上具有多靶点、多环节、多途径及多系统的治疗优势。

卵巢功能包括卵泡的数量和卵泡的质量，所以DOR高度概括起来就是卵泡数量与质量的下降。目前很多研究表明卵泡的减少与卵巢颗粒细胞（GC） 的凋亡有关，所以DOR 的发病机制之一就是GC 的凋亡，而凋亡与B 细胞淋巴瘤 （Bcl-2）/B 细胞淋巴瘤相关X 蛋白（Bax） 的比值密切相关［4］。Bcl-2 抑制颗粒细胞的凋亡，Bax 促进颗粒细胞的凋亡，而Bax 与Bcl-2 通过形成异源或同源的二聚体，共同调节颗粒细胞的凋亡。当Bax 与Bcl-2 形成异源二聚体时，即Bc1-2 比Bax 的比例大时，则抑制颗粒细胞的凋亡；当Bax 与Bcl-2 形成同源二聚体时，即Bax 与Bc1-2 的比值大时，则促进颗粒细胞凋亡［5-6］。

张永芳等［7］通研究发现CTX 能够使大鼠的动情周期发生紊乱，升高FSH 及LH 水平，降低AMH 及E2水平，升高卵巢组织Caspase-3 蛋白表达，降低Bcl-2 蛋白表达，卵巢间质组织纤维化，认为CTX 通过使大鼠卵巢颗粒细胞凋亡、卵巢间质损伤及纤维化而导致大鼠的卵巢功能衰竭。王雪峰等［4］认为卵巢早衰的病机是卵泡的过快衰竭，卵泡颗粒细胞的存亡则取决于Bcl-2/Bax 的比值，Bcl-2/Bax 在卵巢功能的变化中发挥着极其关键的作用。刘惠芳等［8］通过观察大鼠腹腔注射CTX 后，大鼠卵巢组织中的原始卵泡的数目明显减少，从而导致大鼠卵巢功能下降。很多学者［9-11］认为卵母细胞的凋亡及颗粒细胞的凋亡介导了卵泡的闭锁是造成卵巢储备功能下降的根本原因。

此实验结果显示经CTX 造模后，大鼠卵巢组织上的Bax 表达上升，Bcl-2 蛋白表达及AMH 均下降，提示模型组卵巢颗粒细胞Bcl-2 蛋白表达的降低及Bax 蛋白表达的升高有可能加速卵泡的过早凋亡，从而导致了DOR，并由此推测CTX 引起DOR 的机制之一与卵巢的卵泡的凋亡有关。与模型组比较，中药高、中剂量组Bcl-2 蛋白表达及AMH 升高，补佳乐组、中药高、中、低剂量组Bax 蛋白的表达降低，提示补佳乐和加减益经汤能够通过增加卵巢颗粒细胞上Bcl-2 蛋白的表达，降低Bax 蛋白的表达，从而抑制卵泡的过快、过早地凋亡，以进一步起到治疗DOR 的作用。

综上所述，DOR 的发病机制可能与Bcl-2 蛋白低表达和Bax 高蛋白表达导致卵泡过快、过早的凋亡有关。加减益经汤能够通过调控Bcl-2/Bax，即下调Bax 蛋白的表达，上调Bcl-2 蛋白的表达，从而抑制卵泡的过早、过快凋亡，可能是加减益经汤改善卵巢的功能，治疗DOR 的机制之一。