汉中地区羊肚菌人工栽培菌种初步选育研究*

赵航轲 ，彭 浩 **，卢雨欣

（1.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西 汉中 723000）

羊肚菌属于真菌子囊真菌，是世界四大珍贵食用菌之一[1]。其富含多种氨基酸，9种为人体必需氨基酸，约占氨基酸总含量的40%[2]，而且24.5%的蛋白质，具有很高的营养价值[3]。此外，研究发现羊肚菌多糖和蛋白质[4]，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和降低胆固醇等重要活性，对抗肿瘤药物的研究与开发具有重要意义。

羊肚菌生长环境要求较为特殊，子实体形成困难且产量不稳定。关于羊肚菌最早栽培的记载为1883年，之后的100多年有许多关于羊肚菌栽培出菇的报道[5-8]。自1982年羊肚菌室内人工栽培成功以来，世界各地相关研究人员都在羊肚菌人工栽培技术上不断突破更新[9-10]。从羊肚菌的制种、栽培环境、外援营养等生产宏观角度以及从分子生物学水平研究羊肚菌代谢机理等生物学微观角度多方面研究，不断优化羊肚菌人工栽培技术。近年来，国内羊肚菌人工栽培发展迅速，栽培面积不断增大，市场交易量日益增加[11]。但对羊肚菌人工栽培技术尚未完全突破，而实现羊肚菌商业化栽培最重要的是成熟稳定的菌种和良好的栽培环境[12-13]。

汉中市位于陕西的中南部，属北亚热带内陆性季风气候，阳光充足，温度适宜，降雨较多，空气湿度大，雨季一般在9月份[14]。汉中市地处秦巴山区，食（药）用菌种类多，自然条件适宜野生食用菌的生长，据相关文献报道，秦巴山区分布有一百余种野生食药用菌[15]。羊肚菌属偏低温高湿型菌类，在形成原基与子实体时需要大量水分，因此在汉中地区进行羊肚菌的人工栽培具有先天的自然优势。

通过对汉中各地区采集野生及试栽羊肚菌菌株进行试验室分离、纯化、鉴定、制种及人工栽培，经初筛、复筛及中试试验不断进行人工驯化，初步确定适合汉中人工栽培的羊肚菌菌种，为汉中地区羊肚菌高产稳产的商业化栽培奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

供试菌株由陕西省食药用菌工程技术研究中心从各地区收集的野生及试栽羊肚菌，经试验室分离纯化制备菌种，采集地点、形态描述、菌种编号见表1。

表1 野生羊肚菌信息汇总Tab.1 Summary of wild Morchella

1.1.2 培养基

基础培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、琼脂18 g、维生素B110mg，纯化水1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离纯化

将采集的羊肚菌子实体用自来水轻轻冲洗，去除表面附着的泥沙，用灭菌后脱脂棉蘸取75%的乙醇对子实体进行5次表面消毒，用无菌水冲洗5次，去除残留乙醇，将羊肚菌子实体放至装有0.1%的升汞溶液的烧杯中浸泡45 s，取出用无菌水冲洗5次，滤纸充分吸干表面水分，打开鼓风紫外线消毒15min，用无菌操作从菌盖和菌柄结合处切取0.5 mm2块茎，接种至加入抗生素的基础培养基中，并对接种的菌种不断进行转接纯化， 纯化后置于4℃冰箱保存。

菌株鉴定：将纯化好的羊肚菌接种于PDA培养基中进行形态学观察，采用插片法观察其菌丝显微形态，有无分支和菌丝横隔，结合相关参考文献进行初步鉴定。利用 CTAB法提取羊肚菌菌丝体 DNA，真菌引物（ITS 1/ITS 4）进行 PCR 扩增。扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。所得序列在 NCBI 中进行比对分析，结合形态学进行种属鉴定。

1.2.2 菌种制备

原种制备：菌种活化后，制备液体种，170 r·min-1、24℃培养10 d，制备原种。

原种培养基：采用5种培养基制备原种，如表2所示。含水量55%～65%，121℃灭菌4 h晾凉后，无菌接种，至24℃恒温避光培养25 d，以菌丝生长速度、菌核数量、菌丝致密度为标准筛选最佳原种培养基。

表2 原种培养基组成成分Tab.2 Composition of primary medium

栽培种制备：通过原种培养基筛选，将5种长势良好的原种培养基作为栽培种培养基，见表3。通过满袋时间、菌丝致密度、菌核质量选取最终最适栽培种培养基。

表3 栽培种培养基筛选Tab.3 Selection of cultivated species components

1.2.3 栽培地点选择，拱棚搭建及土壤处理

选址和建棚：选择土质疏松、富含腐殖质，pH为5～7，含沙量为15%，喷水及排水良的土壤，建立5 m× 20 m× 2.5 m 规格拱棚，选择透光度为70%左右的遮荫网进行搭建。搭建遮荫棚要注意牢固，大棚四周用薄膜覆盖，棚内面积约为50 m2。注意留有通风口，以保证通风良好。

建畦及开厢：将土壤中的一切杂物去除掉。在处理过的地畦上均匀撒生石灰来消毒。每个大棚内两畦，每畦用工具开播深10 cm、宽15 cm的沟槽，约30 m2，每个菌种栽培两畦。使用生石灰消毒（22.5 g·m-2）后，再进行松土和整地，松土深度为25 cm左右。开厢操作和松土是同步进行的。厢高一般为20 cm左右，宽度约1.2 m，两厢之间需要有厢沟，厢沟用来排水和人员通行。厢沟一般宽0.4 m、深0.25 m左右。

1.2.4 播种及外援营养

选择10月下旬至11月下旬进行播种，温度为4℃～18℃。播种：将所有用具严格灭菌，以防止菌种污染。将长势良好、生命力强、无杂菌污染的栽培种掰成2 cm～4 cm的碎块，均匀撒在之前做好的沟槽内，然后在菌丝上覆盖厚5 cm的土层。在播种后10 d～15 d左右，搁置营养袋以补充营养成分。在营养袋上划出10 cm左右的口，将划开口的一侧紧贴菌床横放，或在营养袋一侧均匀扎孔，将扎一侧紧贴菌床放置，施加密度为3 袋/m2～4 袋/m2。为防止杂菌污染，搁置30 d后，除去营养袋。

1.2.5 出菇管理及采摘

湿度控制：羊肚菌出菇时对水分要求高，此时土壤含水量应提高到70%并保持在一定水平。羊肚菌出菇后应减少土壤含水量，控制在40%～50%，空气湿度保持在55%～90%。

温度控制：出菇棚内应维持在10℃～15℃。出菇后温度应控制在25℃以下，温度过高会灼伤羊肚菌子实体，影响产量。棚内温度过高时应及时通风降温，必要时掀开薄膜大棚，搭建双重以上遮阳网。

光照控制：羊肚菌出菇阶段应减少光照。大棚增加遮荫网以降低透光度至20%左右。

羊肚菌的采收：羊肚菌出菇速度快，采收时间也很短。一般羊肚菌出菇10 d后进行羊肚菌采集。羊肚菌脊棱即将破损的时候及时采收。采集羊肚菌时，用刀在羊肚菌子实体菌柄与土壤相接处平割，勿伤原基。将羊肚菌子实体的形态特征及产量进行详细记录，初步筛选出其中产量高、品质好的菌株。

1.2.6 复筛试验

2016年～ 2017年，在汉中市武乡镇进行栽培试验，分别在林下和大棚进行对比，根据初筛菌丝萌发时间、菌霜期出现时间以及子实体品质和产量，对栽培方式进行优化，结果表明，羊肚菌最适栽培方式是棚内栽培， 便于调整土壤及空气温度、湿度。同时，在播种前对菌种添加拌菌剂，可以为菌种提供一定的营养物质和菌种播种初保持一定湿度。每个菌种做3个重复，每个重复栽培面积为30 m2，详细记录子实体的产量及品质，进一步筛选出其中产量高品质好的菌株进行下一阶段中试试验。

1.2.7 中试试验

2017年～ 2018年，在汉中武乡镇进行栽培试验。营养方式及出菇管理根据复筛进行优化。根据观察，菌丝不能完全利用营养袋，采取缩小体积营养袋、增大单位面积营养袋数量的方式，菌丝可以充分利用营养袋，即在播种后10 d～15 d左右，施加营养袋为4 袋 /m2～6 袋 /m2， 同时在菌丝萌发后，当气温达到零度以下，菌霜不能及时出现，在地畦表面覆盖黑地膜，保持地畦表面土壤温湿度，确保菌丝生长活力。每个菌种做3个重复，每个重复栽培面积为100 m2。

1.2.8 部分地区推广试验

2018年以来，在汉中市武乡、南郑、城固县等羊肚菌栽培基地对筛选出的羊肚菌进行示范推广。

2 结果与分析

2.1 初筛试验结果与分析

对野生羊肚菌进行分离纯化和鉴定后，优化制备栽培种培养基组分为木屑20.0%、谷壳25.0%、小麦32.0%、麸皮10.0%、腐殖土10.0%、生石灰1.5%、石膏 1.5%，播种后 LU-01、LU-02、LU-03、LB-01、NZ-01、NZ-02、NZ-03未出菇，其他羊肚菌菌株子实体出菇产量相对较高，筛选试验见表4。

表4 羊肚菌栽培初筛试验结果Tab.4 Results of Morchella cultivation preliminary screening test

由表4可知，筛选出MX-02、MX-03、MX-04、LB-01、LB-02、LB-03、CG-01 7个为较优菌株。

2.2 复筛试验结果与分析

LB-01、CG-01几乎未出菇，LB-02出菇少，即表明以上菌株稳定性低，抗逆性差，不能进行后续试验，MX-02、MX-03、MX-04、LB-03 4株羊肚菌出菇产量较高、品质较好，见表5。

表5 羊肚菌栽培复筛试验结果Tab.5 Results of Morchella cultivation rescreen test

由表5可知，说明这几株菌具有人工驯化的可能性，可以进行下一步中试试验。

2.3 中试试验结果与分析

根据初筛复筛对试验过程中播种前菌种预处理及播种后棚内保温保湿相关技术改进，进行中试试验，见表6。

表6 羊肚菌栽培中试试验结果Tab.6 Experimental results of Morchella cultivation

由表6可知，MX-02、MX-04、LB-03均能稳定出菇， 且子实体形态稳定， 畸形菇较少，产量较高。

2.4 推广试验结果与分析

将试验筛选出的MX-02、MX-04、LB-03在汉中市武乡镇、城固县、南郑县进行初步推广，其中在武乡推广的MX-02平均产量为2 481 kg·hm-2、MX-04平均产量为2 652 kg·hm-2、LB-03平均产量为2 151 kg·hm-2，在南郑推广的MX-02平均产量为2 227.5 kg·hm-2、LB-03 平均产量为 2 272.5 kg·hm-2，在城固推广的MX-04平均产量为1 882.5 kg·hm-2。

3 结语

试验通过收集汉中市各地区野生及试栽羊肚菌子实体进行分离纯化和鉴定，将纯化后的菌种进行初筛、复筛、中试试验筛选出稳定性和抗逆性较强的羊肚菌菌种。通过播种前将菌种揉碎后添加拌种剂，为菌丝提供一定的含水量及营养物质。营养袋施加过程中通过缩小营养袋体积而增大单位面积施加量，使菌丝能够充分利用营养。出菇管理过程中由于低温造成结霜未及时出现，采用覆膜等方式及时进行保温、保湿等相关技术改进，使羊肚菌产量和性状维持相对稳定的状态。最终得到3株优势较强的羊肚菌，其中MX-02和MX-04为六妹羊肚菌，LB-03为梯棱羊肚菌，为汉中地区羊肚菌的商业化栽培奠定理论基础。