FAM64A在肾癌发生发展中的分子机制

张 洋，李维清，王 燕,3,4，毛龙毅，周颖琛，员海超，桂耀庭,3，李贤新,5，欧龙华，史本涛

肾癌(renal cell carcinoma，RCC)是全球范围内十分常见的肿瘤之一，发病率占所有恶性肿瘤的3%～4%[1]，约占肾脏恶性肿瘤的90%[2]，每年超过20万例新发病例及10万例死亡病例，严重影响人类健康[3-4]。有研究[5]认为RCC的发生与遗传因素及环境因素相关，但是RCC发生发展的分子机制尚不清楚。人类FAM64A基因(磷脂酰肌醇结合网格蛋白相互作用有丝分裂调节因子，phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein interacting mitotic regulator，又名RCS1或CATS)，最初研究[6]显示FAM64A基因在小鼠胚胎时期的心肌细胞中高表达，并证明FAM64A作为有丝分裂的调节因子调节细胞周期；研究[7]表明FAM64A与细胞增殖密切相关，可能作为一个新的细胞增殖标志物。仅有一篇文献[8]报道FAM64A在多种肿瘤组织中高表达，但其作用机制尚不明确。对FAM64A在RCC发生发展的机制研究可为今后寻找RCC分子标志物和基因治疗靶点提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病例资料本研究选取的15 例RCC及其配对癌旁正常组织标本皆来源于选择2013年1月～2015年12月收治于北京大学深圳医院泌尿外科的RCC患者。收集的新鲜组织标本离体后立即加入RNA 稳定剂以防止RNA降解，随后用液氮冷冻运输，并置于-80 ℃冰箱保存备用。所收集的标本均获得患者知情同意，并经过所在医院和北京大学深圳医院医学伦理委员会的批准。每例RCC组织及其配对癌旁正常组织标本均被术后病理证实，正常组织距离癌组织至少5 cm，患者临床病理资料不完整。

1.2 前期转录组测序和筛选本研究前期测序由深圳华大基因公司通过Illumina Hiseq 2000测序仪完成，采用第二代高通量测序的方法筛选在RCC组织及其癌旁正常组织中差异表达的 mRNA，因 FAM64A 在RCC组织中的表达量较低，且目前在泌尿生殖系统肿瘤中未有相关研究报道，故选其作为研究对象。

1.3 组织总RNA的提取从-80 ℃冰箱中随机选取15例RCC及其配对癌旁正常组织，加入液氮进行碾磨，并根据产品说明书操作步骤加入TRIzol(购自美国Invitrogen公司)试剂提取研磨后组织中的总RNA，然后通过NanoDrop 2000c紫外分光光度计测定提取组织的总RNA浓度。

1.4 RNA提取和RT-qPCR检测采用TRIzol裂解细胞，通过氯仿抽提异丙醇沉淀总RNA后，使用Nanodrop-2000紫外分光光度计(美国Thermo Scientific公司)测定RNA浓度。按照 PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书要求(日本TaKaRa公司)，取1 μg RNA，去除基因组DNA后配制反转录体系，使用普通PCR仪完成反转录。以反转录后得到的cDNA为模板，按照SYBR ® Premix Ex TaqTM试剂盒(日本Takara公司)要求配制反应体系，使用荧光定量PCR仪LC480(美国Roche公司)进行实时荧光定量PCR反应，检测FAM64A在RCC组织和RCC细胞中的表达情况。FAM64A上游引物：5′-CCTGAGAGTGTCTTGGGAG-3′，下游引物：5′-ACAGTGGGTGAGTGACTCTG-3′；以 GAPDH 作为内参进行标准化处理(上游引物：5′-CCACTCCTCCACCTTTGACG-3′，下游引物：5′-CTGGTGGTCCAGGGGTCTTA-3′)。

1.5 细胞培养人RCC细胞系ACHN、人胚肾细胞HEK-293和人肾近曲小管上皮细胞系HK-2采用MEM培养基培养，786-0、769-P采用1640培养基，Caki-1和Caki-2细胞采用McCoy′s 5A培养基，均加入10%的胎牛血清、100 U/ml的青链霉素、1×GlutaMAX，置于含有5%CO2的37 ℃恒温饱和湿度培养箱内培养。待细胞密度达到70%～90%时，用含有EDTA的胰蛋白酶消化细胞进行传代，每隔1～2 d换一次细胞培养基。

1.6Westernblot使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶置于TRIs-Glycine SDS 电泳缓冲液电泳分离(SDS-PAGE)。将分离后蛋白置于TRIs-Glycine转膜缓冲液，使用0.2 mm PVDF(美国密理博公司)以330 mA电流转膜60 min。转膜后将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中室温下孵育1 h，然后用FAM64A一抗(美国赛默飞公司，货号#PA5-62098，稀释浓度0.4 μg/ml)，细胞周期素B1(Cyclin B1)一抗(美国CST公司，货号#12231，稀释比例1 ∶1 000)，β-tubulin一抗(英国Abcam公司，货号ab52623，稀释比例1 ∶5 000)于4 ℃孵育过夜。二抗(Anti-rabbit IgG，美国CST公司，货号#7074，稀释比例1 ∶1 000)室温孵育1 h，发光液 (美国密理博公司)1 ∶1混匀。

1.7 CCK-8检测细胞增殖能力在96孔板中接种细胞至 70%～90%密度，转染FAM64A-siRNA组和正常对照组、过表达FAM64A组和正常对照组，每孔加入细胞计数试剂(cell counting kit-8，CCK-8，日本东仁化学公司)反应液10 μl，于细胞培养箱内继续孵育1 h，使用酶标仪测量450 nm处吸光度，设置 0、24、48、72 h 时间梯度分析不同时间点细胞数量，各实验组设置5个复孔。

1.8 细胞周期同步化(胸腺嘧啶核苷双阻断法)取相同生长基数的细胞培养，将正常生长细胞的培养基换为含2 mmol/L胸腺嘧啶核苷的新鲜培养基，阻断26 h后所有的细胞均停止在G1/S期，加入含1 mmol/L胞苷的新鲜培养基开始释放，后每2 h收取一次细胞提取蛋白，得到的蛋白样为细胞周期同步化后由G1/S期开始不同时间点的细胞。

1.9 统计学处理RT-qPCR实验中，采用GAPDH作为内参，根据 RT-qPCR反应后得到的各样本Ct 值，采用2-ΔΔCt法(ΔCt=Ct FAM64A-Ct GAPDH，ΔΔCt=ΔCt tumor-ΔCt normal )进行计算。采用Graphpad prism统计软件进行分析，用t检验比较FAM64A在肾癌及癌旁组织中的表达量，四格法χ2检验比较FAM64A的表达量与临床病理特征之间有无统计学意义，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FAM64A在肾癌组织和肾癌细胞系中的高表达为验证FAM64A在RCC组织中的表达是否与前期转录组测序结果相一致，通过RT-qPCR方法检测FAM64A在15例RCC组织及其配对癌旁正常组织中FAM64A的表达水平。结果显示：15例RCC组织中有12例FAM64A表达水平高于其配对癌旁组织，见图1A；并且RCC组织中FAM64A的mRNA水平明显高于其对应的癌旁组织(P<0.05)，见图1B，这与前期测序结果一致。另外通过比较人肾近曲小管永生化细胞(HK-2)和人肾细胞腺癌细胞(ACHN)、人肾透明细胞癌皮肤转移细胞(Caki-1)、人肾透明细胞癌细胞(Caki-2)、人肾透明细胞腺癌细胞(786-O)、人肾癌细胞(769-P)的FAM64A mRNA水平后发现，肾癌细胞系中FAM64A mRNA表达水平均明显高于HK-2，见图1C，其中在RCC细胞系786-O和Caki-2中FAM64A的表达水平相对较高，其次是ACHN、769-P和Caki-1。上述结果提示FAM64A在RCC组织和细胞系中高表达可能与RCC的发生发展相关。

2.2 不同分期RCC患者FAM64A的表达水平通过肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库筛选510例RCC患者，将所有样本按照RCC组织中FAM64A表达量的平均值为界分为低表达组和高表达组。按照50岁将所有样本分为2组，同时与性别、TNM分期和愈后5年存活率列出四格表，进行χ2检验分析各组间FAM64A表达水平差异。结果显示不同性别、TNM分期、愈后5年存活率之间的FAM64A表达水平差异均有统计学意义，但不同年龄段之间FAM64A的表达水平差异无统计学意义，见表1。510例RCC患者根据FAM64A表达量及愈后时间绘制生存分析，结果显示差异有统计学意义，FAM64A高表达组RCC患者的预后生存率明显降低。见图2。

图1 FAM64A在肾癌组织和细胞系中的表达

A、B ：15例RCC及其配对的癌旁组织的FAM64A的相对表达量；C：FAM64A在RCC细胞系里的表达量；与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

表1 FAM64A的表达水平与患者临床病理特征之间相关性分析(n)

图2 FAM64A的表达量与愈后相关

2.3 FAM64A可以促进RCC细胞的增殖在FAM64A相对高表达的786-O细胞中转染FAM64A特异性小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)后，分别通过RT-qPCR及Western blot检测786-O细胞中FAM64A mRNA和蛋白的表达变化(P<0.05)，见图3A；正常对照组(normal control，NC)，siR1为FAM64A特异性干扰RNA1，siR2为FAM64A特异性干扰RNA2；与正常对照比较，转染FAM64A-siRNA后786-O细胞中FAM64A表达水平明显降低，说明FAM64A-siRNA可下调其表达，同时Cyclin B1的表达量下调，见图3B；CCK-8结果显示，转染FAM64A-siRNA后，786-O细胞的增殖能力受到明显抑制(P<0.05)，见图3C。提示FAM64A可以促进RCC细胞的增殖。在FAM64A相对低表达的ACHN细胞中通过慢病毒感染稳定过表达FAM64A后，通过RT-qPCR及Western blot检测ACHN细胞中FAM64A和Cyclin B1的表达变化(P<0.05)，见图4A； 过表达组(over expression，OE)，慢病毒转染后FAM64A和Cyclin B1的表达水平明显上调，见图4B。CCK-8结果显示，过表达FAM64A后，ACHN细胞的增殖能力明显增强(P<0.05)。见图4C。

2.4 FAM64A能加快细胞G2/M期进程在786-O细胞中通过FAM64A-siRNA敲低FAM64A后，利用细胞周期同步化技术使用过量的胸苷将细胞同步阻滞在G1期后，开始释放，收集不同时间点的细胞提取蛋白，通过Werstern blot方法检测细胞周期G2/M期检测点标志性分子Cyclin B1水平变化，观察FAM64A对细胞周期的影响。结果显示，正常786-O细胞系中Cyclin B1开始升高的时间点为释放后4 h，敲低FAM64A后，Cyclin B1升高时间推迟到6 h。该结果表明过表达FAM64A后得到Cyclin B1水平升高时间提前，可加快细胞通过G2/M期。见图5。

图3 下调FAM64A后786-O细胞的增殖能力

A：FAM64A敲低后mRNA表达水平；B：FAM64A敲低后的蛋白表达水平及Cyclin B1的蛋白表达水平；C：FAM64A敲低后细胞增殖能力；与NC组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 讨论

前期转录组测序首次发现FAM64A在RCC组织中高表达[9]，随后又在15例RCC与癌旁组织以及RCC细胞系中验证了这一结果，发现FAM64A的确在RCC组织和细胞中高表达；同时通过TCGA数据库的数据分析得出FAM64A的表达与RCC患者的性别、肿瘤分级以及预后相关。这提示FAM64A的异常表达可能与RCC的发生发展密切相关。Hashimoto et al[6]报道FAM64A在小鼠胚胎时期的心肌细胞中高表达，并且FAM64A的高表达与心肌细胞的增殖密切相关；但当心肌细胞接触氧后FAM64A的表达量明显下降。Hu et al研究[8]报道FAM64A在多种肿瘤如广泛高表达，敲低FAM64A后可以抑制肿瘤细胞的生长，但其具体分子调控机制尚不明确。

图4 过表达FAM64A后ACHN细胞的增殖能力

A： FAM64A过表达后mRNA表达水平；B：FAM64A过表达后蛋白表达水平及Cyclin B1的蛋白表达水平；C：FAM64A过表达后细胞增殖能力；与NC组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

图5 FAM64A能加快细胞进入M期

Zhao et al[10]研究报道FAM64A作为原癌基因可通过加快细胞通过G2/M期以促进细胞周期，以及细胞增殖；FAM64A有可能作为一个新的细胞增殖标志物[7]。目前为止尚没有FAM64A对RCC细胞发生发展的研究，为了进一步验证FAM64A与RCC细胞增殖的相关性，选择FAM64A相对高表达和低表达的RCC细胞系786-O和ACHN作为研究模型，同干扰RNA敲低FAM64A后786-O细胞增殖减慢，而过表达FAM64A后ACHN细胞增殖加快。Cyclin B1是细胞G2/M期的关键性标志物，Cyclin B1的高表达可加快细胞周期促进细胞增殖。在ACHN细胞中过表达FAM64A后发现Cyclin B1随FAM64A表达量的增加而升高；在786-O细胞系中敲低FAM64A后Cyclin B1随FAM64A表达量的减少而降低。为了进一步验证FAM64A和Cyclin B1的关系，通过细胞周期同步化实验发现FAM64A低表达可以推迟Cyclin B1升高的时间点，进而影响RCC细胞G2期向M期的转换。FAM64A可以通过调控Cyclin B1的表达而影响RCC的细胞周期和增殖。通过对FAM64A肾癌细胞系中的功能研究，确定FAM64A作为原癌基因通过加速RCC细胞通过G2/M期以加速细胞增殖，这提示FAM64A与RCC细胞的增殖密切相关，这为今后靶向治疗提供一定的支持。但FAM64A作用的具体分子机制尚不清楚。Archangelo et al[11]研究表明FAM64A可作为一种激酶的底物被磷酸化，并可与该激酶共同定位在细胞核中进而促进细胞增殖。现阶段研究[6-8,10-11]表明FAM64A在细胞内担当多种功能，但是具体的分子机制和信号通路尚不清楚。这需要后期进一步工作来确定FAM64A的具体分子机制。