红景天苷联合右美托咪定对LPS诱导的人关节软骨细胞凋亡和炎症反应的调节作用

杜 刚，陈 娜，刘晓艳，赵 亮

骨关节炎(osteoarthritis，OA)又称退行性关节炎或退行性骨关节病，主要表现为关节疼痛、僵硬及活动受限等症状[1]。全世界范围内，OA发病率约为15%，在中老年慢性疾病中位列第2位[2]。软骨细胞数目及稳定的功能对于维持软骨稳态、软骨基质合成和降解平衡有着至关重要的作用。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一种高选择性受体激动剂，具有镇静、镇痛等多种功效[3]，研究[4]表明Dex还具有抗炎作用。红景天苷(salidroside，Sal)是红景天的主要活性成分，已有研究[5-6]报道Sal对缺血缺氧心肌以及神经元具有一定保护作用，Sal作用机制与减轻兴奋性毒性、拮抗钙超载及清除细胞内活性氧基团或分子(reactive oxygen species，ROS)等相关。该研究主要探讨Sal和Dex联合用药在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的人关节软骨细胞凋亡和炎症反应模型中对软骨细胞的影响机制。

1 材料与方法

1.1 试剂DMEM细胞培养液、胎牛血清和胰酶均购自美国Gibco公司；赫斯特(Hoechst)染色 3342染色试剂盒(货号：ab228551)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinylaspartatespecificproteinase-9，Caspase-9)(货号：ab32539)、Caspase-3(货号：ab13847)、BrdU(货号：ab8955)、二型胶原蛋白(denatured type II collagen，Collagen II)(货号：ab34712)、聚集蛋白聚糖(货号：ab3778)、MMP-13(货号：ab39012)、p65(货号：ab16502)、p-p65(货号：ab6503)、GAPDH(货号：1056)一抗均购自美国abcam公司； LPS(货号：L2630)购自美国sigma公司；，HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司；ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；白介素6(interleukin-6，IL-6)(货号：E-EL-R0015c)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)(货号：E-AB-10698)、IL-1β(货号：E-EL-M0037c)购自上海博耀有限责任公司。

1.2 仪器PCR仪、电泳仪及半干转膜仪均购自美国伯乐公司；Gel View 6000化学发光凝胶成像系统购自广州云星仪器有限公司。Multiskan GO酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1分离人关节软骨细胞 手术室无菌条件下，获取因外伤进行关节置换患者软骨组织(获得知情同意)，先后使用0.2%胰蛋白酶、0.2% Ⅱ型胶原酶低糖DMEM溶液、0.2%Ⅱ型胶原酶溶液消化30 min，再加入DMEM培养基(含20%胎牛血清、链霉素100 u/ml、青霉素100 u/ml)制成细胞悬液，转入培养皿中，再置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，一般4～6 h后软骨组织块消化完全。观察细胞生长情况，每3 d换液。

1.3.2LPS诱导人关节软骨细胞关节炎及联合用药分组 取传代3次的人关节软骨细胞，分别设置健康对照组(Ctrl组)、LPS诱导模型组(LPS组)、单用Sal组(LPS+Sal组)、单用Dex组(LPS+Dex组)、Dex联合Sal组(LPS+Dex+Sal组)。各组模型中LPS刺激8 h(100 ng/ml)，Sal(50 μg/ml)和Dex(100 nmol/l)连续使用48 h。收集细胞备用。

1.3.3Hoechst染色 对药物处理的细胞培养48 h后进行染色处理：吸尽培养液后加入0.5 ml固定液固定10 min；去除固定液用PBS洗2次，每次3 min；加入0.5 ml Hoechst染色液染色5 min；用PBS洗2次，每次3 min；滴加抗荧光淬灭封片液盖上盖玻片荧光显微镜下观察。

1.3.4免疫荧光染色 操作步骤按照说明书进行，细胞接种于预先用0.01%多聚赖氨酸包被的盖玻片，经药物处理后，进入4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗，用含Triton X-100封闭液在冰上通透5 min；吸掉通透液，加入预温的封闭液，室温下封闭1 h；孵育一抗4 ℃过夜。次日，PBS漂洗，孵育荧光标记的二抗(浓度为1 ∶200)，室温避光孵育1 h，PBS漂洗，50%甘油-指甲油封片，立即避光共聚焦显微镜观察。

1.3.55-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)检测细胞增殖 取处理后各组软骨细胞对6孔细胞板进行铺板，1×105个/孔。加入BrdU，37 ℃孵育40 min；弃培养液，培养板用PBS洗涤3次，甲醇固定10 min；经过空气干燥，0.3% H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶；5%正常兔血清封闭，甲酰胺100 ℃、5 min变性核酸；冰浴冷却后PBS洗涤，加一抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1 ∶50)，阴性对照加PBS，Hoechst衬染，在显微镜下随机选择10个视野，进行参数统计。

1.3.6Western blot检测细胞中蛋白表达 收集4组细胞，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解，用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白。用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，10% SDS-PAGE分离蛋白后用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗于4 ℃封闭过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL曝光显影。SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，经5% BSA封闭后依次孵育相应一抗和二抗。显色并统计灰度值计算相对表达量。

1.3.7ELISA检测炎症因子 取各组细胞上清液低温4 000 r/min离心8 min，取出上清液供实验使用。加样：分别设空白孔、标准品待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 μl，待测样品孔先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl。温育：用封板膜封板后置于37 ℃温育30 min。配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍后备用。洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。加酶：每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。温育：再次用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。洗涤：再次小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。显色：每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min。终止：每孔加入50 μl终止液，终止反应(此时蓝色立转为黄色)。测定：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光值(optical density，OD)。测定在加终止液后15 min内进行。

2 结果

2.1 Sal联合Dex抑制人关节软骨细胞凋亡水平Hoechst染色实验结果表明，Ctrl组软骨细胞着色较浅、均匀分布，细胞形态均一；与Ctrl组比较，LPS组软骨细胞核着色较深，数量增多(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+Sal组和LPS+Dex组软骨细胞核着色深度有所降低，数量减少(P<0.01)；与LPS+Dex组比较，LPS+Sal+Dex组软骨细胞核着色显著降低，数量明显减少(P<0.01)，见图1。对各组样品进行Western blot检测发现，与Ctrl组比较，LPS组Caspase-3和Caspase-9表达量显著增高(P<0.01)；

图1 不同处理组软骨细胞凋亡情况

A：Hoechst染色鉴定细胞凋亡情况×400；B：不同处理组细胞凋亡率统计分析；与Ctrl组比较：**P<0.01；与LPS组比较：##P<0.01；与LPS+Dex组比较：△△P<0.01

与LPS组比较，LPS+Sal组和LPS+Dex组Caspase-3和Caspase-9表达量明显减少(P<0.01)；与LPS+Dex组比较，LPS+Sal+Dex组Caspase-3和Caspase-9表达量则显著降低(P<0.01)，见图2。

图2 Western blot检测不同处理组细胞中Caspase-3和Caspase-9表达水平

与Ctrl组比较：**P<0.01；与LPS组比较：##P<0.01；与LPS+Dex组比较：△△P<0.01

2.2 Sal联合Dex促进软骨细胞增殖BrdU染色实验显示，Ctrl组软骨细胞着色数量较多；与Ctrl组比较，LPS组软骨细胞着色数量显著减少(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+Sal组和LPS+Dex组软骨细胞着色数量有所增加(P<0.01)；与LPS+Dex组比较，LPS+Sal+De组软骨细胞着色数量增加显著(P<0.01)。见图3。

2.3 Sal联合Dex促进软骨细胞分泌功能蛋白Western blot实验显示，与Ctrl组比较，LPS组软骨细胞分泌Collagen Ⅱ和软骨蛋白聚糖水平显著降低，基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinases-13，MMP-13)表达能力显著上升(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+Sal组和LPS+Dex组软骨细胞分泌Collagen Ⅱ和软骨蛋白聚糖水平有所提高，MMP-13表达量有所下降(P<0.01)；与LPS+Dex组比较，LPS+Sal+De组软骨细胞分泌Collagen Ⅱ和软骨蛋白聚糖水平显著升高，分泌MMP-13能力显著下调(P<0.01)。见图4。

2.4 Sal联合Dex降低软骨细胞分泌炎症因子ELISA检测细胞样本中相关炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β结果显示，与Ctrl组比较，LPS组软骨细胞分泌炎症因子水平显著增强(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+Sal组和LPS+Dex组软骨细胞分泌炎症因子水平有所下降(P<0.01)；与LPS+Dex组比较，LPS+Sal+Dex组软骨细胞分泌炎症因子能力显著下调(P<0.01)，见图5。

2.5 Sal联合Dex抑制软骨细胞中NF-κB p65信号活性为了进一步探究Sal对Dex在人软骨细胞炎症中的调节作用，通过免疫荧光技术检测不同处理组细胞中p65入核情况(使用Hoechst对软骨细胞进行背景染色)，与Ctrl组比较，LPS组软骨细胞核几乎全部为阳性(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+Sal组和LPS+Dex组软骨细胞核阳性率有所下降(P<0.01)；与LPS+Dex组比较，LPS+Sal+Dex组软骨细胞核阳性率显著下降(P<0.01)，见图6。同时，使用Western blot对各组软骨细胞中核转录因κB p65(nuclear transcription factor κB p65，NF-κB p65)激活清况进行检测。与Ctrl组比较，LPS组软骨细胞NF-κB p65激活水平显著升高(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+Sal组和LPS+Dex组软骨细胞中NF-κB p65激活情况有所下降(P<0.01)；与LPS+Dex组比较，LPS+Sal+Dex组软骨细胞中NF-κB p65活性显著下调(P<0.01)，见图7。

图3 BrdU染色检测软骨细胞增殖×400

与Ctrl组比较：**P<0.01；与LPS组比较：##P<0.01；与LPS+Dex组比较：△△P<0.01

图4 Western blot检测显示软骨细胞相关蛋白表达水平

与Ctrl组比较：**P<0.01；与LPS组比较：##P<0.01；与LPS+Dex组比较：△△P<0.01

图5 ELISA法检测软骨细胞相关因子表达水平

与Ctrl组比较：**P<0.01；与LPS组比较：##P<0.01；与LPS+Dex组比较：△△P<0.01

3 讨论

我国传统藏药红景天富含Sal，具有抗衰老、抗氧化应激等药理作用。Dex除了具有镇静、镇痛等作用外，同时还可以通过激活胆碱能抗炎通路，使单核/巨噬细胞TNF-α等炎症因子的合成、释放明显减少，从而抑制全身过度炎症反应[7]。Luo et al[8]研究证实，在非小细胞肺癌A549细胞系中，Dex可以通过降低C/EBP同源蛋白信号通路的活性来抑制凋亡的发生；而Wang et al[9]同样在A549细胞中证明Dex可以通过α2-肾上腺素能受体来激活抗凋亡的通路，抑制凋亡的发生。有实验报道称OA软骨氧浓度明显低于正常软骨，低氧环境又促进缺氧诱导因子-1α( hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)表达水平上调[10]。HIF-1α可以激活TGF-β1分子[11]以活化纤维蛋白溶酶原(plasminogen activator, PA)来减少胶原蛋白合成；通过PA诱导TNF-α上调，激活下游Caspase-3和MMP-13通路[12]；上调MMP抑制因子1表达从而降解下游靶蛋白以减少软骨细胞内胶原蛋白合成[13]。本研究结果证明，LPS诱导的人关节软骨细胞产生大量炎症因子IL-6、TNF-α等。对LPS+Dex组软骨细胞进行Sal联合Dex处理后，细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β等减少，并且细胞内Caspase-3和Caspase-9都发生明显降低，并且还促进软骨细胞的增殖比例。同时也检测到Collagen Ⅱ和Aggrecan蛋白分泌增加，MMP-13分泌显著下调。表明Sal可以促进Dex对软骨细胞功能改善，可以有效抑制软骨细胞凋亡，同时还可以促进细胞增殖速率。

图6 各处理NF-κB p65表达定位及活性

A：免疫荧光检测各处理组NF-κB p65表达定位及活性×400；B：免疫荧光检测各处理组NF-κB p65表达结果统计分析；与Ctrl组比较：**P<0.01；与LPS组比较：##P<0.01；与LPS+Dex组比较：△△P<0.01

图7 Western blot检测各处理组NF-κB p65表达水平

与Ctrl组比较：**P<0.01；与LPS组比较：##P<0.01；与LPS+Dex组比较：△△P<0.01

TGF-β信号分子在多种重要信号途径中参与多细胞应答，如细胞增殖、分裂、凋亡、免疫及验证应答等[14]。TGF-β1一方面降低p-NF-κB p65和TNF-α活性来降低炎症因子IL-6、IL-17等来抑制免疫炎症[15]，另一方面还可以结合TNF-α共同抑制Caspase-3依赖的凋亡通路来抑制凋亡发生。实验结果表明，正常组软骨细胞p-p65和TNF-α表达水平较低，且p-NF-κB p65极少入核；经过LPS诱导之后两者水平显著升高，p-NF-κB p65大量进入细胞核，Dex虽然可以有效降低二者表达水平，但是在经过Sal处理后细胞p-NF-κB p65和TNF-α等表达水平进一步降低，p-NF-κB p65入核现象也得到明显改善。说明Sal可以有效促进Dex对细胞内NF-κB p65激活，并且进一步影响下游相关基因的表达。