兔肾下腹主动脉阻断对子宫缺血/再灌注损伤的影响

王海霞，陈先侠，卢晓倩，季燕雯，孙嘉敏，江梅花，刘 敏，孔令霞，汪陶荣，陈晓宇

随着“二孩”政策的实施，瘢痕子宫再次妊娠的孕妇明显增加，胎盘植入的发生率呈上升趋势。在胎盘植入患者剖宫产术中，临床目前常常采用腹主动脉球囊阻断术，即通过阻断腹主动脉减少出血，但阻断腹主动脉易造成子宫缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/RI)，子宫平滑肌收缩乏力，易引起孕妇产后出血的发生[1]。I/RI的程度与缺血时间有关[2]，如何在有效的阻断时间内尽量减少并发症的发生亟待解决。同时，再灌注子宫损伤的发病机制尚未完全阐明，但研究[3]表明，Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)和核因子-κB/p65(nuclear factor-κB/p65，NF-κB/p65)与I/RI关系密切。为进一步明确腹主动脉阻断后再灌注导致子宫平滑肌损伤，收缩乏力，该研究通过阻断家兔肾下腹主动脉建立I/RI动物模型，观察血清炎性细胞因子改变以及不同缺血/再灌注时间点家兔子宫组织TLR4和NF-κB/ p65表达情况，探讨腹主动脉阻断的安全时效和部分机制，为临床安全应用腹主动脉阻断术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料① 实验动物：健康清洁级新西兰白兔40只，雌性，体质量(2.07±0.31) kg，饲养环境温度20 ℃,湿度40%，由安徽医科大学动物实验中心提供。② 试剂盒：兔和人白介素-6(interleukin-6, IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) ELISA试剂盒购自上海碧云天试剂公司；羊抗兔TLR4、NF-κB、β-actin一抗购自美国Santa Cruz生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1动物分组及模型制备 将雌兔随机分为4组，分别为假手术组(A)、缺血20 min组(B)、缺血40 min组(C)、缺血60 min组(D)，每组10只兔子，兔子用20%乌拉坦(5 ml/kg)麻醉，左侧卧位固定于手术台上，右下腹部切口，暴露腹主动脉，在髂总动脉分叉上方1.0 cm用动脉夹阻断腹主动脉，至阻断平面以下动脉搏动消失为准，阻断相应时间后去除动脉夹恢复血流。假手术组(A)：手术步骤同缺血组，暴露腹主动脉，但不作腹主动脉阻断。

1.2.2标本采集 B、C、D 3组分别在术前(T0)、再灌注10 min(T1)、再灌注40 min(T2)和再灌注90 min(T3)4个时间点抽取2 ml颈静脉血，对照组在与D组相同时间点抽血，以2 000 r/min离心后取血清，-20 ℃冻存备用。再灌注90 min后，处死家兔，取部分子宫组织，10%甲醛固定48 h后脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察子宫结构改变。另取部分子宫组织样本，转移至液氮中冷藏备用。

1.2.3ELISA法检测血清TNF-α、IL-6浓度 操作步骤按说明书进行，于波长450 nm检测样本光密度(optical density, OD)值，绘制标准液曲线，从曲线中得出各组血清中TNF-α和IL-6浓度。

1.2.4免疫组织化学SP法检测子宫TLR4、NF-κB/p65表达和结果数量判定 操作步骤按照使用说明书进行。组织常规脱水、石蜡包埋，厚4 μm连续切片，烤片、脱蜡、微波抗原修复，山羊血清封闭，滴加一抗(1 ∶200稀释)50 μl，4 ℃孵育过夜，冲洗后滴加生物素标记的二抗(1 ∶200稀释)50 μl，滴加DAB工作液显色，苏木精复染，中性树胶封固。以PBS代替一抗为阴性对照。利用Nikon 4500显微镜摄片，TLR4、NF-κB表达阳性染色结果为细胞质或胞核染色成棕黄色。

1.2.5Western blot法检测蛋白的表达 按照BCA试剂盒说明书，取冻存的子宫组织，组织匀浆后提取和测定组织蛋白，调整上样蛋白质浓度，行SDS-PAGE凝胶电泳，分离1.5 h后，200 mA恒流下2 h，转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，PBST(10 min×3次)洗去封闭液，羊抗TLR4、NF-κB/p65和β-actin多克隆抗体(稀释度均为1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日，摇床上PBST(10 min×3次)洗涤后，将PVDF膜放入通用型二抗中，在摇床上37 ℃温箱中孵育0.5 h。ECL显色，Image J软件半定量进行分析，以β-actin为内参，比较子宫组织TLR4、NF-κB/p65条带与β-actin的OD值，进行分析。

2 结果

2.1 血清TNF-α、IL-6浓度指标重复测量方差分析结果TNF-α的组间比较差异有统计学意义(F=10 906.626，P<0.001)，各时间点比较差异有统计学意义(F=9 260.965，P<0.001)，组间与时间点之间存在交互效应(F=4 241.84，P<0.001)。IL-6的组间比较差异有统计学意义(F=175 188.5，P<0.001)，各时间点比较差异有统计学意义(F=73 139.39，P<0.001)，组间与时间点之间存在交互效应(F=40 778.52，P<0.001),见表1。

通过各组TNF-α、IL-6两两比较，各组在T0时，血清TNF-α、IL-6浓度差异无统计学意义；D组在T1、T2、T3时间点血清TNF-α、IL-6浓度均高于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05)；C组在T1时点IL-6浓度高于A组和B组，在T2和T3时间点TNF-α、IL-6浓度均高于A组和B组，但明显低于D组(P<0.05)；A组和B组在各个时间点差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。随着再灌注时间的延长，C组和D组TNF-α、IL-6表达呈明显上升趋势，在T2和T3时刻达到持平。

表1 TNF-α、IL-6指标重复测量方差分析结果

表2 4组血清细胞因子浓度比较

与A组比较：*P<0.05；与B组比较：#P<0.05；与C组比较：△P<0.05

2.2 子宫内膜光镜下变化D组子宫内膜组织细胞及间质明显水肿，渗出增加，肌纤维排列紊乱，部分溶解，可见较多炎细胞浸润和充血；C组子宫内膜组织细胞及间质肿胀，肌纤维排列尚整齐，部分细胞及间质可见炎细胞浸润减少，明显轻于D组；A组和B组子宫内膜组织细胞及间质、肌纤维结构清晰，内膜子宫腺体几乎无炎细胞浸润。见图1。

2.3 免疫组织化学SP法检测组织TLR4、NF-κB/p65蛋白的表达免疫组织化学SP法结果显示，相对于未阻断血流的A组，TLR4阳性染色结果在B、C、D 3组表达较高，且随着缺血时间的延长，TLR4阳性染色表达呈现正相关趋势，阳性表达由子宫腺间质逐渐向肌间结缔组织弥散，见图2；NF-κB/p65阳性染色结果与TLR4相类似，相对于未阻断血流的A组，NF-κB/p65阳性染色表达在B、C、D 3组中随着缺血时间的延长，呈现正相关趋势，而对照A组表达明显降低。见图3。

2.4 Western blot检测子宫肌组织中TLR4、NF-κB/p65蛋白表达情况Western blot结果显示，正常对照组子宫组织中TLR4、NF-κB/p65蛋白低表达，而腹主动脉阻断后的B、C、D 3组TLR4、NF-κB蛋白表达升高，且随着阻断时间的延长，C组、D组TLR4、NF-κB蛋白表达较正常对照明显升高；应用Image J软件比较灰度比值，C组和D组子宫肌组织中TLR4/β-actin、NF-κB/β-actin较对照组升高，差异有统计学意义(F=5.037，P<0.05)，见图4。

3 讨论

剖宫产术后，再次妊娠孕妇中胎盘植入患者明显增多，为减少剖宫产术中出血，常常需要阻断腹主动脉，但阻断血流时间过长，复灌时会发生平滑肌I/RI[1]。同时，在缺血/再灌注过程中，炎症反应被证实在多种器官或组织的损伤中发挥重要作用[2]。在缺血阶段，炎症细胞向肌肉组织及间质浸润以及产生氧化应激，加剧缺血损伤，导致子宫平滑肌收缩功能障碍。在剖宫产术应用腹主动脉阻断术中，部分患者再次恢复血流后出现子宫瘫软，收缩不佳，子宫血管窦不能闭合导致大量出血，严重威胁患者的生命安全。目前对于腹主动脉阻断的安全时限的探讨都以临床表现为依据，无客观实验验证。本研究通过不同时间阻断家兔腹主动脉，观察子宫内膜和平滑肌的损伤程度，结果表明，在20 min内的腹主动脉阻断中，子宫内膜间质水肿和炎细胞浸润不明显，是较为理想的阻断腹主动脉安全时间点。

图1 4组兔子宫内膜光镜表现 HE×100

图2 4组兔子宫组织TLR4阳性表达情况 SP×200

图3 4组兔子宫组织NF-κB/p65阳性表达情况 SP×200

图4 子宫组织中TLR4、NF-κB/p65蛋白表达情况

炎性反应在I/RI中越来越受到重视，Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)与炎症反应有关，其中TLR4是TLRs家族的重要亚型之一，近年研究[4]显示I/RI与TLR4信号通路的激活有关，TLR4活化后可以上调TNF-α、IL-6等炎性因子的表达。TNF-α主要由单核-巨噬细胞分泌，激活血管内的炎性细胞，诱导产生IL-6等炎性因子的释放，严重缺血时可诱使多形核白细胞堵塞小毛细血管，加重组织缺血损伤[5]。本研究中，T0时，各组血清TNF-α、IL-6浓度处于较低水平；腹主动脉阻断后B组在T1、T2、T33个时间点血清TNF-α、IL-6浓度升高不明显，但随着腹主动脉阻断时间延长，C组和D组在再灌注后血清TNF-α、IL-6浓度均升高，炎症反应加重，且D组再灌注损伤最明显，其在再灌注后各时间点TNF-α、IL-6浓度均较其他3组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

NF-κB是TLR下游信号通路居中心地位的转录因子，抑制TLR下游级联反应中的NF-κB可以减轻炎症反应[6]。NF-κB能与多种基因启动子或增强子上的κB 位点发生特异性结合并促使基因转录，参与调节炎症过程中多种细胞因子和细胞黏附因子表达，在感染性疾病和自身免疫性疾病的发病中可能发挥重要作用[7]。在哺乳类细胞中有5种NF-κB家族成员，其中p65是NF-κB家族中的一个重要亚基，在炎症反应中的作用明确[8]。研究[9]表明，子宫I/RI可导致能量代谢障碍，引起氧化应激，促进炎症细胞浸润。本实验同时检测了各组雌兔血清TNF-α、IL-6和子宫平滑肌TLR4、NF-κB/p65的表达情况，结果表明，对照组各时点血清及子宫平滑肌组织中各指标含量差异无统计学意义，提示缺血/再灌注造成了子宫平滑肌损伤。有研究[10]表明，缺血/再灌注的大鼠子宫存在氧自由基和炎症因子大量产生的病理状态，推测子宫缺血导致能量代谢障碍，局部细胞因子、炎症介质激活导致自由基产生，再灌注后，子宫释放大量自由基和炎症因子导致子宫肌纤维损伤。通过减轻I/RI过程中的炎症反应可能起到保护子宫I/RI的作用，缺血的时间直接影响再灌注损伤的严重程度。本研究显示，缺血再灌注后各时点血清TNF-α、IL-6含量均升高，随着缺血时间以及再灌注时间的延长，TNF-α、IL-6表达呈上升趋势。B组血清中TNF-α及IL-6浓度随着再灌注时间的延长都略有升高，但与缺血前比较差异无统计学意义，且B组子宫平滑肌中TLR4、NF-κB/p65表达较少，因此可以推断腹主动脉阻断20 min内是安全的。C组在再灌注后血清TNF-α及IL-6浓度明显升高，但升高程度均小于D组，在光镜下，C组子宫平滑肌损伤较轻，呈现可逆性损伤，因此腹主动脉阻断40 min造成的I/RI较轻。

综上所述，本动物实验验证阻断20 min是阻断兔腹主动脉的安全时效，在必要情况下可延长至40 min，对机体损伤较小。此安全时效可为临床使用腹主动脉球囊阻断技术提供参考依据，但本研究仅仅检测部分器官缺血再灌注损伤情况，仍需进一步实验检测多脏器以更全面地验证其安全性。