T细胞急性淋巴细胞白血病中NOTCH1突变与地塞米松耐药相关性

谢蓓蓓，李丽丽，夏瑞祥

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一种发生在B细胞系或T细胞系的未成熟淋巴细胞或淋巴祖细胞的血液造血系统恶性疾病，在生物学特征、临床特征及预后等方面具有很大异质性，其中T细胞急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)约占成人ALL的15%[1]。目前对成人T-ALL患者的治疗主要采取化疗和异基因造血干细胞移植，但总体预后较差，化疗抗性为原因之一。该研究通过高通量测序及体外药敏方法检测54种白血病相关基因及81种化疗药物敏感度，寻找耐药相关基因，并初步分析该基因临床特征。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2016年10月～2018年1月就诊于安徽医科大学第一附属医院血液科的初诊T-ALL患者38例，其中男21例，女17例，年龄在16～80(50.50±15.59)岁，中位年龄50岁，所有T-ALL患者诊断及分型均符合张之南 等[2]主编的《血液病诊断及疗效标准》。初诊治疗前抽取外周静脉血4～8 ml行高通量测序及体外药敏试验。成人T-ALL 患者均使用 VDCLP或VICLP方案治疗，化疗1个疗程后复查骨髓判断疗效。

1.2 方法

1.2.1细胞分离及培养方法 Ficoll密度梯度离心法分离样本，预热淋巴细胞分离液和细胞培养液RPMI 1640至室温，将淋巴细胞分离液加入离心管中，取2倍量的Hank′s液或RPMI 1640与肝素抗凝静脉血充分混匀，叠加于分层液面上，常温水平离心1 350 r/min、30 min,吸取离心后中间层中单个核细胞，加入5倍体积的Hank′s液或RPMI 1640，1 500 r/min离心10 min，洗涤细胞2次。末次离心后，弃上清液，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640，重悬细胞。取重悬的细胞悬液10 μl, 加入80 μl RPMI 1640培养基、10 μl台盼蓝染液充分混合后，死细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。

1.2.2高通量测序方法 分离提纯的单核细胞进行DNA抽提，NanoDrop鉴定纯度。DNA与探针混合后加温至95 ℃、1 min，再让样本探针缓慢降温到40 ℃。除未杂交上的探针，延伸并连接杂交上的探针行PCR扩增。采用AMPure XP 纯化PCR完成后的产物并进行质控，上机检测。共检测54个白血病相关基因，见表1。

1.2.3体外药敏试验方法 按照1×105～1×106个细胞/ml在细胞加样槽中充分混匀后进行培养，每孔细胞数目为5×103～5×104/个。分别对每孔加入0.1 μl所测药物，培养箱中孵育72 h后，加入10 μl CellTiter-Glo 细胞增殖荧光检测试剂，静置10 min，Envision Plate-Reader读数。药物名称见表2。

表1 54种基因检测列表

表2 81种体外药物检测列表

1.3 统计学处理采用SPSS 23.0进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料中非正态分布数据以中位数表示，采用非参数检验，均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高通量测序结果在38例成人T-ALL患者中，NOTCH1突变率最高，NOTCH1突变有18例，占47.3%，总共发现18个突变，其中13个点突变，4个缺失突变，1个插入突变。在18例NOTCH1阳性患者中，其中14例存在点突变，4例存在缺失突变，1例存在插入突变。余20例患者未发现NOTCH1突变，见表3。

表3 18例NOTCH1基因突变患者突变类型及突变位点

2.2 体外药敏结果对38例患者行88种药物体外药敏试验发现，地塞米松耐药性高，在地塞米松浓度为3.3 μmol/L时，19例患者对地塞米松耐药，其中NOTCH1阳性者占13例，阴性者占6例，地塞米松浓度为1.1 μmol/L时，21例患者对地塞米松耐药，其中NOTCH1阳性者占14例，阴性者占7例，地塞米松浓度为0.37 μmol/L时，22例患者对地塞米松耐药，其中NOTCH1阳性者占16例，阴性者占6例，不同浓度下，NOTCH1突变组与非突变组在地塞米松敏感性两组结果之间差异均有统计学意义(P=0.002、P=0.011、P<0.001)。见表4。38例患者临床化疗方案为长春新碱1.4 mg/m2第1、8、15、22天+柔红霉素40 mg/(m2·d)第1～3天+环磷酰胺750 mg/m2第1～3天+左旋门冬酰胺酶6 000 IU/m2第11、14、17、20、23、26天+地塞米松0.15 mg/(kg·d)第1～28天(第15天后逐渐减量)(VDCLP)或长春新碱1.4 mg/m2第1、8、15、22天+去甲氧柔红霉素8 mg/(m2·d)第1～3天+环磷酰胺750 mg/m2第1～3天+左旋门冬酰胺酶6 000 IU/m2第11、14、17、20、23、26天+地塞米松0.15 mg/(kg·d)第1～28天(第15天后逐渐减量)(VICLP)，在18例NOTCH1突变组患者中，CR 15例，非CR 113例，20例NOTCH1非突变组患者，CR 116例，非CR 14例，两组间差异有统计学意义(P=0.003)。体外药敏试验与实际临床缓解率之间差异无统计学意义(P<0.05)。

表4 NOTCH1突变与不同浓度地塞米松敏感性相关性

2.3 NOTCH1突变患者临床特征18例NOTCH1突变组中，男性9例，女性9例，20例NOTCH1非突变组中，男性12例，女性8例，性别差异无统计学意义(χ2=0.383，P=0.438)，NOTCH1突变组与非突变组的年龄、初诊时白细胞计数、骨髓原始细胞数、血红蛋白、LDH水平差异无统计学意义(P>0.05)，血小板计数差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

3 讨论

成人急性淋巴细胞白血病预后相对较差，对糖皮质激素耐药是引起儿童及成人预后差异的重要原因之一[3]，糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是T-ALL治疗中的重要化疗药物，贯穿于T-ALL治疗的整个过程，糖皮质激素通过与激素受体(glucoticoid receptor，GR)结合后进入细胞核内，启动下游凋亡途径来发挥诱导白血病细胞凋亡和溶细胞作用[4]，但其耐药机制目前尚未完全明确。NOTCH1是一种Ⅰ型膜蛋白受体及配体激活型转录因子，最初认为是以B细胞发育为代价指导T细胞谱系定型所必需[5]，T细胞恶性肿瘤几乎都有NOTCH信号通路的活化[6]，如今已经发现了其对T细胞白血病中的致癌潜力[7-8]。在NOTCH1信号传导途径中，当配体与其细胞外结构域结合时，NOTCH1跨膜受体被激活，首先引起两个连续的蛋白水解切割事件，进而通过激活PI3K-AKT-mTOR通路、NOTCH1-cMYC信号通路、NF-κB通路等导致T-ALL的发生[9-13]。

表5 NOTCH1突变与各因素相关性[M(P25，P75)]

为了解NOTCH1突变是否引起化疗抗性，本研究对所有患者行体外药敏试验，结果提示18例NOTCH1突变患者对三种不同浓度的地塞米松均表现出耐药性，0.37 μmol/L时有16例对地塞米松耐药，1.1 μmol/L时有14例对地塞米松耐药，3.3 μmol/L时有13例对地塞米松耐药，由此可见NOTCH1突变可引起对化疗药物地塞米松耐药。

目前有大量临床系列研究分析了NOTCH1突变与临床预后的相关性，大多数的研究认为NOTCH1基因突变的T-ALL预后较好，本研究显示，NOTCH1突变组的18例患者中，有5例获得CR1，13例未达到CR1，无NOTCH1突变组的20例患者中，有16例获得CR1，4例未达到CR1，突变组CR1率明显低于非突变组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示NOTCH1基因突变可能为预后不佳指标。刘卉 等[14]研究显示， NOTCH1突变组患者2年累积总生存率和无事件生存率低于无突变者，突变组的复发率高于非突变组，本研究结果与之相似。

进一步分析NOTCH1突变组的临床特征可见，NOTCH1突变组和非突变组的年龄、性别、初诊时白细胞计数、骨髓原始细胞数、血红蛋白、LDH差异均无统计学意义，血小板计数差异有统计学意义，NOTCH1突变组患者具有更低的血小板计数，本研究结果显示NOCTH1突变未引起高肿瘤负荷，但可导致血小板计数降低，可能带来较大的出血风险。

本研究结果提示，NOTCH1突变可引起对地塞米松耐药，引起较差的治疗效果，针对该类患者据体外药敏结果行精准医疗有望改善预后。由于本研究样本量较少，后期可通过扩大样本量进一步核实NOTCH1突变与地塞米松耐药之间相关性，并建立动物模型了解耐药发生机制，寻找阻断耐药方法。