LncRNA XIST在急性髓系白血病中的表达及其临床意义

刘 军，郑慧敏，丁洋洋，李曼曼，胡林辉，蒲莲芳，陶千山，熊术道

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类髓系造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，是成人白血病中最常见的一种类型[1]。尽管大多数的AML患者在接受化疗后能够达到完全缓解，但AML患者的总体5年生存率仍然很差，约为30%～40%[2]。因此，仍需对 AML发生发展的机制及预后因素进行深入研究。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一类长度大于200 bp、不具有或者很少具有编码蛋白质功能的RNA[3]，其不仅参与了机体细胞正常的生理过程，还参与了肿瘤发生发展的病理过程[4]。近年来，越来越多的功能性LncRNAs逐渐被发现且已成为研究的热点。研究[5-6]表明X染色体失活特异性转录因子(X inactive specific transcript，XIST)LncRNA在多种肿瘤，比如胃癌、结肠癌及食管癌等可以促进肿瘤的发生发展。在血液肿瘤中，XIST的研究极少，有研究[7]表明XIST在小鼠血液肿瘤中起到抑癌作用。然而，其在人类AML中的作用尚不明确。该研究旨在探讨 LncRNA XIST在人类AML患者骨髓标本中的表达水平及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2016年5月～2018年11月在安徽医科大学第二附属医院血液科及儿科血液病区经国际上通用的是细胞形态学(morphology)、免疫学(immunology)、细胞遗传学(cytogenetics)和分子生物学(molecular biology)分型，即常说的MICM分型确诊105例初诊的AML患者为研究对象(AML组)，其中男57例，女48例，年龄0～84岁，中位年龄49岁，其中儿童18例，成人87例；经法国(Franch)、美国(American)和英国(Britain)等3国血细胞形态学专家讨论和制订了关于急性白血病的分型诊断标准，即为FAB分型。据此标准将急性非淋巴细胞白血病(acute non-lymphocytic leukemia，ANLL)分成M0-M7共8个亚型，其中急性髓细胞白血病微分化型(M0)2例、急性原始粒细胞白血病未成熟型(M1)5例、急性原始粒细胞白血病部分成熟型(M2)41例、急性早幼粒细胞白血病(M3)21例、急性粒-单核细胞型白血病(M4)17例、急性单核细胞白血病(M5)17例和急性巨核细胞白血病(M7)2例。收集2016年5月～2018年11月在安徽医科大学第二附属医院血液科及儿科血液病区经MICM分型确诊20例且化疗达到完全缓解(complete remission，CR)AML患者(AML-CR组)，其中男8例，女12例，年龄11～80岁，中位年龄41岁。同期选择性别与年龄相符，且符合缺铁性贫血(iron-deficiency anemia, IDA)国际标准的IDA 患者20 例作为对照组(control,CON)。所有入组者所留取的标本均为骨髓。所有入选者均签署知情同意书；本研究经我院伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂和设备RNA提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；总RNA逆转录试剂盒购自美国Thermofisher公司；Real-Time PCR(SYBGreen)试剂盒购自日本Takara公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和LncRNA XIST 上下游引物购自上海生工生物工程股份有限公司；天隆TL988荧光定量PCR仪购自西安天隆科技有限公司。

1.3 样本收集、RNA提取及逆转录应用EDTA 抗凝管收集对照组(CON)、初治AML组(AML)和化疗后达完全缓解组(AML-CR)患者骨髓液2 ml，用红细胞裂解液裂解红细胞后1 500 r/min离心5 min，弃上清液后加入1 ml TRIzol充分吹打细胞沉淀，移至1.5 ml EP管中，标记保存于-80 ℃，通过经典吸附柱法，按照说明书所述，抽提留存的骨髓标本中的总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度，逆转录待用。采用美国Thermofisher公司的RT试剂盒按其说明书步骤配置反应体系，在普通PCR仪提前设置好的反应条件下将RNA逆转录cDNA，-20 ℃保存。

1.4 引物设计与合成在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找LncRNA XIST基因序列，由上海生工生物工程公司设计并合成正反向引物，引物序列见表1。GAPDH 基因序列参照文献[8]由上海生工生物工程公司合成。

1.5 qRT-PCR按照Real-Time PCR(SYBGreen)试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(购自日本Takara公司)说明书操作，以cDNA为模板，反应体系为20 μl，加入反应试剂进行qPCR反应。反应体系包括：模板 cDNA 2 μl、 SYBR 10 μl、GAPDH或者LncRNA XIST的正反向引物各0.8 μl、加无菌蒸馏水至总反应体积20 μl。qPCR反应条件：95 ℃、 30 s预变性；之后95 ℃变性5 s、60 ℃延伸30 s，共计完成45个循环。每个样品均设2个复孔，PCR扩增结束后可获取扩增循环数(cycle threshold，CT)值，以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算LncRNA XIST的相对表达量。

表1 LncRNA XIST 和GAPDH的引物序列

1.6 统计学处理采用GraphPad Prism 6.01和SPSS 19.0进行统计分析。采用配对t检验分析配对组间LncRNA XIST表达量的差异。采用四格表χ2检验判断LncRNA XIST表达量与临床特征的相关性。采用Kaplan-Meier 方法和Log-rank检验分析 LncRNA XIST表达量与AML患者总生存期之间的关系，进一步通过 COX比例风险模型分析不同临床特征和LncRNA XIST表达量对AML患者预后影响因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA XIST在AML患者骨髓标本中的表达情况qRT-PCR法检测LncRNA XIST在 105 例初治AML患者(AML) 和20例 AML-CR及20例IDA患者(CON)中的表达。结果显示，LncRNA XIST在AML患者中的表达量较AML-CR及IDA (CON)患者明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)，而LncRNA XIST在20例 AML-CR组患者与20例对照组患者中的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图1A。另外，LncRNA XIST在20例AML初治(AML)患者中的表达量与这20例患者化疗达到完全缓解后相比较明显减低(AML-CR)(n=20)，差异有统计学意义(P<0.001)。见图1B。

2.2 LncRNA XIST的表达水平与AML患者临床特征的相关性初治AML组中，以LncRNA XIST相对表达量2-ΔΔCt值的中位数为界将AML患者分为高表达组、低表达组，其中高表达组55例、低表达组50例；根据性别、患者年龄中位数、AML分型(M2-M3/M4-M5)、美国国家综合癌症网络(national comprehensive cancer network， NCCN)分级、有无髓外浸润、骨髓原始细胞比例、白细胞水平及乳酸脱氢酶中位数等将患者分为两组。分别列出四格表，进行χ2检验。结果显示LncRNA XIST表达水平和患者性别、年龄、NCCN分级、化疗2周期达完全缓解、骨髓原始细胞比例、血红蛋白和血小板水平及白球比无关，但与AML分型(M2-M3/M4-M5)、有无髓外浸润、白细胞数及乳酸脱氢酶水平有相关性(P<0.05 )。见表2。

图1 AML中LncRNA XIST的表达水平

A：CON组、 AML组和AML-CR组骨髓标本中LncRNA XIST相对表达量的比较； 与对照组(CON) 比较：***P<0.001；与AML完全缓解组(AML-CR)比较：***P<0.001；B：AML组和AML-CR组骨髓标本中LncRNA XIST相对表达量比较；与AML初治组(AML)比较：***P<0.001

2.3 LncRNA XIST的表达水平与AML患者总生存时间关系及其预后影响因素分析对纳入研究的所有105例初治AML组的患者进行了常规随访，随访期内死亡35例(33.3%)。初治AML组中，以LncRNA XIST相对表达量将AML患者分为高表达组和低表达组，采用Kaplan-Meier法和Log-rank 检验比较两组AML患者的生存率，生存曲线见图2。结果显示低表达组的生存时间(0.03～30.9)个月，中位时间8.6个月，低表达组随访期生存率(35.5%)明显低于高表达组(70.8%)(P<0.05)。进一步采用COX多因素回归分析进行独立预后影响因素价值的判断，结果显示白球比和LncRNA XIST的表达是影响AML患者独立的预后因素(HR=0.029，95%CI：0.002～0.415，P=0.009；HR=0.052，95%CI：0.003～0.915，P=0.043)。见表3。

表2 LncRNA XIST的表达水平与AML患者临床特征的相关性

图2 LncRNA XIST的表达水平与AML患者总生存时间的关系

表3 多因素COX回归分析AML患者的独立预后因素

3 讨论

AML是一种髓系造血干/祖细胞异常克隆的高度异质性造血系统恶性肿瘤，其病因和发病机制极其复杂[9]。现在普遍认为该病主要是遗传因素、化学因素、电离辐射、环境因素等多种致病因素协同作用的结果[10]。

近年来，随着对LncRNA功能和机制的不断研究发现，LncRNA在多种疾病的发生发展过程中均起到了重要的调控作用。研究[11]显示，LncRNA通过参与肿瘤的细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭以及迁移等多种生物学进程，从而在肿瘤的发生和发展过程中发挥促癌或抑癌作用。例如，LncRNA 结肠癌相关转录物作为一种竞争性内源性RNA调节急性髓系白血病细胞的生长和分化[12]。过表达细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A启动子反义DNA损伤激活RNA可预测AML的不良预后[13]。本研究中的LncRNA XIST最初发现于1991年人类细胞中，位于X染色体X灭活中心，通过参与介导X染色体沉默来发挥功能。后续大量研究[5-6]表明，XIST在多种实体肿瘤中表达是明显上调的，且与肿瘤的大小、有无远期转移、肿瘤的分期及预后都具有相关性，可作为肿瘤标志物用于肿瘤的诊断及影响肿瘤的预后。同样XIST在卵巢癌中也发挥了促癌基因的作用参与肿瘤的发生发展，而在乳腺癌中XIST既有高表达也有低表达的研究报道，这可能与乳腺癌及卵巢癌的抑癌基因乳腺癌1号基因有很大关联[14]。本研究首次利用qRT-PCR检测LncRNA XIST在AML患者中的表达水平，结果显示LncRNA XIST在初治的AML患者的骨髓标本中的表达明显下调，化疗完全缓解后明显上调并与IDA对照组相比差异无统计学意义。本研究结果与XIST在多种实体肿瘤中高表达是有所不同的，但与XIST在乳腺癌中低表达的报道较一致，由此提示XIST的表达与肿瘤的类型及形态的差异可能是有关的，但还需扩大实验进一步验证。

目前有关LncRNA XIST的研究大多报道于实体肿瘤中，而在血液肿瘤中的研究罕见报道。有研究[7]表明在小鼠动物模型中敲除XIST导致小鼠患骨髓增殖性肿瘤。在人类血液肿瘤中，仅有报道利用生物信息学分析预测XIST可能在急性B细胞型淋巴细胞性白血病的发展中发挥重要作用，可作为潜在的治疗靶点[15]，而在AML中的研究未见报道。因此，本研究具有原始创新性。本研究也表明，LncRNA XIST表达水平的不同与AML分型、有无发生髓外浸润、白细胞数以及乳酸脱氢酶水平等临床参数具有相关性。进一步分析显示低表达组的LncRNA XIST的生存率明显低于高表达组。同时，本研究还采用了COX多因素回归分析影响AML预后的独立因素，研究发现白蛋白与球蛋白比值和LncRNA XIST可能是其独立的预后因素，其他临床参数包括乳酸脱氢酶水平、AML分型和有无髓外浸润等无统计学意义，其原因可能是各个临床参数之间的相关性或者临床参数与LncRNA XIST表达水平的高低只是间接影响因素导致的，下一步可扩大病例数验证上述结果，同时在白血病细胞株中深入研究LncRNA XIST在白血病中的作用及可能的机制。