血清炎症因子与SLE患者眼表状态的相关性研究

王 安，顾正宇，廖荣丰，帅宗文

前期研究[1]已经证实不伴有继发性干燥综合征(secondary Sjögren's syndrome, sSS)的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者的干眼发病率及严重程度与SLE的活动度相关，然而具体机制尚不明确。为了进一步探索影响此类患者发生干眼的因素，该实验拟研究血清细胞因子与此类患者干眼临床体征的相关性。

基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)是一种基质金属蛋白酶，它在炎症、伤口的愈合和细胞凋亡的过程中发挥着重要作用。在干眼小鼠模型中，MMP-2参与到干眼的发生发展中[2]。白介素(interleukin，IL)-1，IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)属于前炎症因子，干眼人群泪液中的IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子的浓度较健康对照组升高[3]，并且这些细胞因子与干眼的临床指标呈现密切相关性[4]。激肽释放酶13(kallikrein 13， Klk13)是激肽系统的主要限速酶，对血压、电解质及炎症反应均有调节作用。关于Klk13对于干眼的影响尚无统一定论，该研究将Klk13作为一个候选细胞因子纳入此项研究。

1 材料与方法

1.1 患者入选标准诊断符合SLE且不伴有其他的自身免疫性疾病，通过抗干燥综合征A抗体 (Sögren's syndrome A antibody, anti-SSA antibody)和抗SSB抗体排除干燥综合征患者，并且这些患者否认口干病史。患者过去1周无眼药水使用史，无角膜接触镜佩戴史。患有白内障、玻璃体积血、视网膜脱离、翼状胬肉、角膜新生物、睑板腺功能障碍等疾病将从研究对象中去除。根据2017年泪膜眼表协会和干眼世界工作组II (tear film & ocular surface society and dry eye workshop II, TFOS DEWS II)干眼诊断共识，将纳入研究的患者分为3组：眼表疾病指数(ocular surface disease index，OSDI)≥13且泪膜破裂时间(tear film break-up time，TBUT)<10 s定义为干眼组(n=11)，OSDI≥13或TBUT<10 s定义为干眼倾向组(n=25)，OSDI<13且TBUT≥10 s定义为对照组(n=18)。

1.2 干眼指标的测定泪河高度，第1次泪膜破裂时间和平均泪膜破裂时间通过眼表综合分析仪keratograph 5M(德国Oculus公司)测定。患者的干眼症状通过国际公认的OSDI量表评估。

1.3 主要试剂MMP-2一抗、Klk13一抗、IL-1、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒购自美国R&D systems公司； BCA蛋白浓度测定试剂盒购自海门市碧云天生物技术研究所；β-actin一抗、二抗购自北京中杉金桥公司。

1.4 主要仪器酶标仪购自美国BioTek公司；电泳、转膜、凝胶成像系统购自美国Bio-Rad 公司。

1.5 实验方法

1.5.1血液样本的收集及准备 患者的外周静脉血通过采血针收集到5 ml含有EDTA-K2抗凝剂的采血管中，将采血管放入高速离心机中以3 000 r/min离心5 min致使血清及血细胞上下分层，将上层血清分离到1.5 ml EP管中，勿吸到下层血细胞。将上述分离的血清放入-80 ℃冰箱冻存，以备进行下一步检测。

1.5.2Western blot检测MMP-2、Klk13在各组中的相对蛋白表达量 通过BCA法测量蛋白浓度，调整蛋白上样量使每孔加入的蛋白总量相同。样品用上样缓冲液及巯基乙醇处理。10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离后，300 mA的电流恒流转膜1.5 h。转膜完成后，按照所需蛋白分子量大小将PVDF膜切割成相应大小，再将这些膜放入5%的脱脂奶粉中完成封闭。将含有目的蛋白的膜与相应1 ∶1 000抗体在4 ℃下孵育12 h，TBST漂洗3次，每次10 min，再将膜放入含有1 ∶5 000二抗的溶液中振摇2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，再向膜上加ECL显色液在X光下胶片曝光。β-actin被用作内参。Image J用来测量图片的灰度值，用目的蛋白/β-actin代表目的蛋白的相对表达水平。

1.5.3ELISA法测量IL-1、IL-6、TNF-α在各组中的浓度 严格按照R&D公司的ELISA试剂盒的操作步骤进行实验。按照各浓度梯度稀释标准品，取100 μl血清样品加入各个抗体包被好的孔中室温孵育2 h，盖上封口膜以防污染，之后用洗板机洗板，再向各孔中加入200 μl酶标抗体，室温孵育2 h，洗板机洗板，再向各孔中加入100 μl显色液，孵育半小时后向各孔中加入50 μl终止液，加入终止液后半小时内在酶标仪下读取450 nm的吸光度(optical density, OD)，与标准曲线对比，计算出各样本的蛋白浓度。

1.6 统计学处理采用SPSS 19.0、GraphPad Prism 6.0、Matlab 2017b进行统计分析和作图。所有的数据进行正态分布检验，对于符合正态分布的数据，用单因素方差分析比较3组之间的差异。对于不符合正态分布的数据，用Kruskal-Wallis test比较3组之间的差异。对于符合正态分布数据间的相关分析，用Pearson相关分析，对于不符合正态分布的数据间的相关分析，用Spearman相关分析。P<0.05(双侧)为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人群基线比较分析了年龄、病程、性别、相关抗体等指标在3组患者之间的差异，3组人群基本可比。在泪河高度(P<0.001)、第一次泪膜破裂时间(P<0.001)、平均泪膜破裂时间(P<0.001)、OSDI(P<0.001)这几项指标中，3组人群之间的差异有统计学意义。见表1。

2.2 Western blot检测各组MMP-2、Klk13的结果MMP-2在3组之间呈渐进性的改变，与对照组比较，干眼组患者血清中MMP-2的蛋白含量显著升高，两者之间的差异有统计学意义(P=0.016)。见图1A、B。Western blot结果显示，Klk13蛋白含量在3组之间的差异无统计学意义(P=0.621)。见图1C。

2.3 ELISA法检测3组患者中的IL-1、IL-6、TNF-α的含量比较3组患者血清中IL-1的浓度，差异有统计学意义(P<0.001)，IL-1在干眼倾向组(209.52±263.27) ng/L的表达量最高，而在干眼组(114.87±169.86 )ng/L中的表达量反而降低。比较3组患者IL-6的血清浓度，差异无统计学意义(P=0.268)。TNF-α在3组中呈梯度改变，干眼组(362.17±247.28 ) ng/L与对照组(122.65±125.38 ) ng/L之间的差异有统计学意义(P=0.014)。见图2。

2.4 干眼指标和炎症因子的相关分析MMP-2与OSDI之间(r=0.328,P=0.001)存在正相关，IL-1与泪河高度(r=-0.358,P<0.001)、第1次泪膜破裂时间(r=-0.424,P<0.001)、平均泪膜破裂时间(r=-0.472,P<0.001)之间均存在负相关，TNF-α与泪河高度(r=-0.211,P=0.037)、平均泪膜破裂时间(r=-0.278,P=0.006)、OSDI(r=0.238,P=0.018)之间均存在相关性。Klk13与所有的干眼指标均不存在相关性，IL-6与所有的干眼指标也不存在相关性。见表2、图3。

3 讨论

本研究通过临床干眼相关检查指标将不伴有sSS的SLE患者分为3组，分别探索各组患者外周血血清中细胞因子的含量及其与干眼指标的相关性。

研究结果显示，MMP-2在干眼组、干眼倾向组和对照组中呈现逐渐降低的趋势，并且MMP-2在干眼组和对照组中的差异有统计学意义，由此可认为MMP-2参与到干眼的发生中。研究表明活性氧/环加氧酶2/超氧化物歧化酶1/过氧化物酶4通路[5]、Toll样受体通路[6]在角膜上皮细胞模型中参与到干眼的发生过程中，并与MMP-2的升高可能有关联。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路可能与MMP形成恶性循环参与到干眼的形成过程中，抑制鞘氨醇-1-磷酸受体可能会打破MAPK和MMP形成的恶性循环，从而改善干眼状况[7]。

研究[3]证实在干眼患者泪液中IL-1的表达量较对照组明显增高，有研究[8]证实在干燥综合症小鼠模型的结膜和泪腺组织中，IL-1在蛋白水平和基因水平均较野生型对照组上调。本实验的研究结果与之相符，证明IL-1参与到干眼的发病过程中。IL-1受体(IL-1R)在调节炎症和免疫反应中起重要作用。IL-1与IL-1R结合后，募集IL-1R辅助蛋白(IL-1 receptor accessory protein, IL-1RAcP)以形成高亲和力的IL-1R1/IL-1RAcP异二聚体受体，启动下游炎症级联信号，例如核因子κB信号、MAPK信号等，这也许解释了干眼倾向组与对照组之间的差别。然而干眼组与对照组之间无差别，可能原因是IL-1属于早期炎症因子，晚期抗炎症因子细胞，如调节性T细胞活化释放抗炎症因子可拮抗炎症因子的作用[9]。

表1 纳入研究的SLE患者的基本资料

图1 Western blot检测3组患者血清中MMP-2、Klk13的相对表达量

图2 ELISA检测3组患者血清中IL-1、IL-6、TNF-α的浓度

图3 TNF-α的浓度与平均泪膜破例时间、泪河高度、OSDI的相关性

表2 SLE患者血清中细胞因子与干眼临床资料的相关性

TNF-α是由1型辅助性T细胞分泌的细胞因子，在抗原呈递的过程中具有重要作用。研究[9-10]显示，TNF-α在干眼动物模型的泪液、结膜、泪腺等组织的表达量较对照组明显增高，这与本研究结果一致。此外，在干眼小鼠模型中，TNF-α阻断剂能阻断眼表的炎症反应并改善眼表症状[11]。从相关性分析可看出，TNF-α更适合作为干眼症患者的血清学标志物，因其与泪河高度、平均泪膜破裂时间、OSDI等干眼的相关指标均具有相关性。

本研究结果显示IL-6在3组之间无差别，这与Jackson et al[12]研究结果相同，但与Lin et al[13]研究结果不同。研究[14]证实IL-6在人角膜上皮细胞模型中的表达量在干眼组较对照组增高。本研究结果与其他研究结果不同的一个可能原因是选取的研究对象为SLE患者，这些患者的整体炎症因子的水平较高，可能在3组之中的差别不明显。此外，样本量较小也是一个可能原因。

有研究[15]显示在干眼小鼠模型的血清中可检测到Klk13，而在野生对照组小鼠血清中无Klk13的存在。然而，在本研究中，3组患者血清中的Klk13无明显差异，这可能与样本的物种差异有关。

综上所述，本研究测定了不同眼表状况的不伴有sSS的SLE患者血清中相关细胞因子，结果显示MMP-2、IL-1、TNF-α这些细胞因子参与到干眼的发生过程中，并且TNF-α可能可以作为诊断干眼的一个血清学指标。本研究是首个探索MMP-2、Klk13、IL-1、IL-6、TNF-α在不伴有sSS的SLE患者血清中的含量与干眼临床指标相关性的研究。MMP-2、IL-1、TNF-α影响干眼发生的具体机制及通路是下一步需要探讨的问题。