噬菌体裂解酶作为抗菌剂的潜在价值

袁玉玉，丛聪，王丽丽,2,4，李晓宇,2,4，李淑英，徐永平,,*

(1 大连理工大学生物工程学院, 辽宁大连 116024；2 动物性食品安全保障技术教育部工程研究中心，辽宁大连 116600；3 大连赛姆生物工程技术公司, 辽宁大连 116620;4 辽宁省大连赛姆噬菌体应用工程技术研究中心，辽宁大连 116600)

抗菌药物耐药性(Antimicrobial drug resistance，AMR)是全世界日益增长的挑战。新的抗性机制的出现及其通过纵向和横向基因转移的广泛分布令人震惊。因此，多重耐药(MDR)细菌正在全球传播，且MDR细菌感染的全面影响仍然未知。噬菌体疗法作为一项开拓性的医学创新，在其基础科学尚未得到初步了解之前就已经开始实施。因此，使用噬菌体作为治疗药物产生了许多问题，尤其是由于对噬菌体生物学缺乏深刻的理解。特别是，与任何抗菌药物治疗一样，关键是使用一些具有一定潜力的制剂，首先在体外，然后在体内，作为靶向微生物的有效拮抗剂，并在其应用中是安全的。噬菌体裂解酶是噬菌体感染宿主晚期表达的一类肽聚糖水解酶。噬菌体裂解酶作为治疗制剂具有以下特点：(1)具有高度保守的种属特异性，不会伤害机体细胞，也不干扰正常的菌群；(2)具有高效、快速的杀菌机制，可在短时间内裂解细菌；(3)不易产生抗性。裂解酶是一种蛋白质分子，不易刺激细菌产生抗性。近年来建立的多种动物感染模型，初步体现了裂解酶用于耐药细菌感染治疗的潜力与优势。本文将噬菌体裂解酶的结构和功能进行了简要的介绍，重点综述了裂解酶作用机制与应用前景。

1 裂解酶结构与作用机制

针对革兰阳性菌和革兰阴性菌的裂解酶结构通常是有差异的，这反映了细菌群体之间的细胞壁结构差异。来自革兰阳性菌的裂解酶已经发展到利用模块化设计，其中催化活性和底物识别被分别称为细胞壁结合结构域(cell wall binding domains，CBD)和酶促活性结构域(enzymatically active domains，EAD)的两种不同类型的功能结构域[1,2,3]。EAD赋予酶的催化机制(即，裂解细菌肽聚糖内的特异性键)，但有一些裂解酶的CBD能将蛋白质靶向其底物，并在细胞裂解后保持其紧密结合到细胞壁碎片，从而阻止扩散，以及破坏周围尚未被噬菌体感染的完整细胞[4]。相比之下，革兰阴性菌的外膜(outer membrane，OM)可以通过限制裂解酶从外部进入肽聚糖层来防止这类附带损害，这可能解释了为什么来自感染革兰阴性宿主的噬菌体的裂解酶主要是小的单域球状蛋白(分子量在15到20 kDa之间)，通常没有特定的CBD模块[5]。与革兰阳性菌的裂解酶相比，这类裂解酶可能会更好地发挥酶的催化作用(辅助细胞裂解过程中的多个催化反应)，这类酶结合到一个位点会具有非常低的释放率[6]。但也有例外情况，据报道，来自假单胞菌噬菌体(KZ144和EL188)的两种革兰阴性菌的裂解酶具有N末端CBD和C末端EAD的模块化结构。N端部分的KZ144以高亲和力与铜绿假单胞菌细胞壁结合并识别其他革兰阴性细菌的PG[7]。另一方面，金黄色阳性的裂解酶主要具有相反的功能模块取向，其中EAD位于N端，CBD在C端[8-10]。

2 裂解酶的安全性

从安全角度来看，裂解酶的高度特异性是其最有益的特性之一。特别是在食品安全和医疗应用中，这些酶特异性地破坏目标病原体而不影响共生菌群，这一事实使得它们比许多常用的抗生素或化学防腐剂更有优势。关于人或动物体裂解酶的全身施用，主要关注的是释放与细菌裂解有关的促炎细胞碎片如磷壁酸、脂磷壁酸和肽聚糖，这可能潜在地导致严重的并发症，例如感染性休克和多器官衰竭[11]。Entenza等发现通过连续静脉输注Cpl-1治疗的小鼠中促炎性细胞因子浓度增加[12]。而Witzenrath及其同事报道，相同酶在12h内间隔施用时，细胞因子浓度比未处理动物低[13]。这两个研究之间的差异可能是由于高浓度持续暴露于Cpl-1使细菌细胞壁碎裂增强，导致促炎性分子水平升高[14]。最后，由于它们的蛋白质性质，裂解酶是无腐蚀性和生物可降解的[15]。

3 裂解酶在医药方面的应用

细菌可以定殖和感染人体任何部位。因此，裂解酶能够到达感染部位是重要的。注射裂解酶已成为主要的施用途径进行应用及研究。目前，有几种类型的注射已被证明其在动物模型中的功效：静脉内[16-18]、玻璃体内[19]，腹膜内[20-22]和脑池内[23]。而且，SAL200和CF-301目前都在临床上II期临床试验(表1)注射[24]。注射主要是为了评估在动物模型中治疗全身性感染如脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎和菌血症。P128是一种具有抗葡萄球菌活性的嵌合型酶，并已配制成水凝胶[25]。水凝胶由羟乙基纤维素、丙二醇和甘油组成。Abouhmad等[26]将T4裂解酶与纤维素融合模块用于将裂解酶固定在纤维素纱布材料上，通常用于伤口敷料。融合蛋白保留了其抗革兰阳性菌的活性，同时不可逆地将裂解酶束缚于敷料纱布上。而且，固定化蛋白质的含量更高、热稳定性更好和搁置寿命更长。在一项后续研究，作者表明，固定的纤维素纳米晶体上的T4裂解酶进一步增强了抗血管生成作用和保质期[27]。

表1 生产裂解酶的公司及临床研究

4 裂解酶在食品安全中的应用

许多研究已经证明了噬菌体裂解酶用于控制和检测食源性病原体的可能性。同样，裂解酶优于其他抗微生物的一大特性是它们对目标病原体具有高度特异性，使食物的天然性和经常需要的细菌菌群保持不变。一个明显的控制策略是加入纯化的裂解酶作为生物防腐剂的食品。Obeso及其同事发现，葡萄球菌噬菌体裂解酶LysH5在巴氏消毒牛奶中迅速杀死金黄色葡萄球菌，在4h内将细菌数量降至检测水平以下[28]，并与细菌素乳酸链球菌素协同作用[29]。据报道裂解酶FCTP1在牛奶或奶制品中有活性[30]。一个有趣的发现是三种李斯特菌噬菌体裂解酶Ply118，Ply511和PlyP35具有高耐热性，在90℃、30min后仍保持相当大的裂解活性。这些热稳定酶可用于经过热处理的食品中，例如巴氏消毒奶制品[31]。噬菌体裂解酶也可在固体食物表面保持抗菌功效，研究显示，将果实浸泡在产生欧文菌噬菌体裂解酶的大肠埃希菌细胞的裂解物中，能抑制梨上的解淀粉欧文菌的生长[32]。

尽管在食品中的应用尚未得到证实，但已经有报道来自李斯特菌和梭菌噬菌体以及葡萄球菌裂解酶在检测食品添加剂方面取得了重大进展，使用高亲和力的CBD作为标准检测方法的替代品[33-35]。Kretzer等研究表明，在食物中天然和人为污染与单核细胞增生李斯特菌相比，使用涂有李斯特菌噬菌体CBD的顺磁珠，基于CBD的磁分离可以达到＞90%的检出率[36]。证明该方法在灵敏度和时间要求方面优于标准电镀程序，并且也适用于检测其他病原体，如蜡状芽孢杆菌和产气荚膜梭菌。此外，有研究已经证明了将这种高度灵敏的技术与实时PCR定量相结合的可能性[37]。将具有不同细胞壁特异性的8种不同的李斯特菌噬菌体裂解酶CBD与各种不同颜色的蛋白偶联，建立了一套用于血清学菌株特异性对李斯特菌细胞进行显微检测和分化的工具集[6]，该方法能够区分不同的单核细胞增生李斯特菌。基于CBD的检测方法也被报道用于炭疽杆菌[38,39]。在后者的研究中，裂解酶PlyG的C-末端区域得到的十氨基酸合成肽被证明能够耦合到荧光QDOT®纳米晶体，并足够能应变特异性检测炭疽芽孢杆菌替代物。

5 展望

在过去5年中，关于噬菌体裂解酶文献数量大幅度增加，这些酶在医学、食品、农业和生物技术领域的应用潜力也得到开发。从医学角度来看，噬菌体裂解酶特别适用于局部应用的治疗方法，从而规避或减少与全身给药相关的许多潜在风险。然而，最近涉及裂解酶治疗动物感染模型的研究提出裂解酶有望在长期全身治疗中成为抗生素的合适替代品。