噬菌体治疗海水养殖动物常见细菌性疾病的研究进展

崔惠敬，耿慧君，王丽丽,2,4，李晓宇,2,4，李淑英，徐永平,,*

(1 大连理工大学生物工程学院，大连 116024；2 教育部动物性食品安全保障技术工程研究中心，大连 116600；3 大连赛姆生物工程技术公司, 大连 116620;4 辽宁省大连赛姆噬菌体应用工程技术研究中心，大连 116600)

1 前言

2016年我国水产品总产量达到6901.25万吨，其中海产品产量为3490.15万吨，海水养殖产品产量为1963.13万吨，我国的水产养殖业有了较大的发展，作为世界上唯一养殖产量超过捕捞量的国家，我国的水产养殖业发展迅速，成为国民经济的重要组成部分。然而，随着规模化和集约化养殖水平的提高，海水动物养殖业病害问题日趋严重，已成为制约海水养殖发展的一个重要因素。其中细菌是导致水产动物病害的主要病原，占生物源性疾病的57.6%[1]。

目前，主要依赖抗生素及消毒剂等化学药物防治细菌性疾病。但由于人们对抗生素及消毒剂等化学药物的过分滥用和依赖，导致细菌耐药性不断提高、环境污染日趋严重，且水产品中的药物残留问题呈上升趋势。残留的药物成分一旦进入人体，不但会影响肠道菌群，还会抑制免疫系统，严重危害人类健康。而耐药菌株感染，已成为联合国粮食及农业组织(FAO)公认的限制水产养殖业发展的重要因素[2]。为了减少微生物耐药性的发生和蔓延以及控制水产养殖中的疾病，必须寻找抗生素替代品。

目前，所研究的抗生素替代品有很多，免疫防治虽然是水产动物疾病控制的有效途径，但我国鱼用疫苗研发及应用相对滞后，可用于商品化的鱼用疫苗数量极其有限，远不能满足水产动物疾病防治的需求。因此，水产养殖中急需寻找安全、天然无残留的抗生素替代品用于水产养殖动物的病害防治。目前报道具有潜在应用前景的水产用抗生素替代品包括中草药[3]、植物精油[4]、卵黄免疫球蛋白[5]和噬菌体[6]等。

噬菌体(Bacteriophage，简写Phage)是生物圈中发现的最丰富的生物。噬菌体无处不在，仅需要一个细菌宿主，便可以进行繁殖。最近，噬菌体被用作治疗病原菌的新型治疗剂，引起了人们对噬菌体治疗的兴趣[7]。噬菌体治疗可以作为一种与生态友好的抗生素替代品来预防和控制水产养殖中的病原菌。在20世纪20年代Félix d'Hérelle首次尝试将噬菌体治疗用于人类的临床实验。有趣的是，这些早期的噬菌体治疗试验取得了令人印象深刻的结果。然而，研究结果极具争议性，因为研究中存在着诸如用量控制不充分和未能设计对照组等问题[8]。由于缺乏重复性导致结果不一致，因此人们对噬菌体治疗的研究兴趣下降[9]。此外，许多化学抗生素的发现及其易用性进一步降低了人们对噬菌体治疗研究的兴趣。与此同时，噬菌体治疗研究继续在苏联、东欧和法国进行。

20世纪80年代初，人们重新开始对噬菌体治疗产生了新的兴趣，主要是由于多重耐药(MDR)菌株的增多和寻找可替代抗生素等化学治疗方法的愿望[10]。本文综述了噬菌体在防治海水养殖动物疾病方面的研究及应用，并展望了噬菌体防治海水养殖动物病害的前景，以期为海水动物养殖的绿色健康发展提供参考。

2 噬菌体的生命周期

噬菌体可进行两种不同的生命周期：裂解周期和溶原周期。噬菌体附着于宿主菌表面的特异性受体上，并将其遗传物质注入宿主细胞中。宿主细胞提供了复制噬菌体遗传物质和产生后代噬菌体所需的分子构建物和酶。噬菌体编码的蛋白质如溶菌酶和穿孔素从宿主细胞内部进行裂解。穿孔素是小蛋白，积聚在宿主的细胞质膜中，使内溶素降解肽聚糖，并使子代噬菌体泄漏。随后，在外部环境中，裂解性噬菌体可以感染和破坏所有邻近细菌细胞。利用裂解性噬菌体产生大量的子代是裂解性噬菌体用于噬菌体治疗的优势，但裂解性噬菌体具有狭窄的宿主范围并感染特定的细菌种类。可以通过噬菌体鸡尾酒疗法来克服这种缺乏广泛宿主范围的问题。在溶原性生命周期中，温和噬菌体不立即裂解宿主细胞；取而代之的是，它们的基因组插入到宿主染色体的特定位点上。这种噬菌体DNA在宿主基因组中被称为前噬菌体，含有前噬菌体的宿主细胞称为溶原性细菌。前噬菌体随着细菌宿主基因组一起复制，建立稳定的关系。在噬菌体治疗中使用温和噬菌体的缺点是，一些噬菌体群体将其基因组插入宿主染色体，并休眠或改变宿主的表型。除非该溶原性细菌暴露于不利的环境条件，否则溶原周期可以继续下去。噬菌体之间的感应信号各不相同，但在抗生素治疗、氧化应激或DNA损伤中激活了细菌SOS应答时，通常诱导前噬菌体的激活[11]。一旦溶原周期终止，噬菌体DNA和随之而来的裂解周期开始表达。

根据噬菌体的侵染机制，噬菌体治疗海水养殖动物疾病主要是利用其对致病菌的裂解作用，杀死水体和动物体内的致病菌，从而降低或防止发病几率。由于溶源性噬菌体不能快速裂解致病菌，起不到防治的效果。因此，人们一般筛选裂解性噬菌体用于治疗疾病。

3 噬菌体治疗在海水养殖动物中的应用研究

细菌可引发节肢动物、软体动物、棘皮动物以及脊索动物等多种海水养殖动物的传染性疾病或感染性疾病。一旦养殖场中出现细菌性疾病，如若不及时处理，就会导致大面积的传染，引起养殖动物发病，甚至死亡，从而造成巨大的经济损失。在海水养殖细菌性疾病中，已知的病原菌有迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freudii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V. harveyi)、嗜环弧菌(V. cyclitrophicus)、大菱鲆弧菌(V. scophthalmi)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)等。目前细菌性疾病的防治主要还是依赖抗生素和人工合成抗菌药，目前我国水产用抗生素共有4个品种，分别是氨基糖苷类的硫酸锌霉素粉，四环素类的盐酸多西环素，酰胺类的氟苯尼考和甲砜霉素；另含磺胺类和喹诺酮类两大人工合成类抗菌药物，共11个品种[12]。但农业部2292号公告决定自2016年12月31日起，停止在食品动物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和诺氟沙星4种喹诺酮类抗菌药[13]，这也给水产动物病害防治带来了挑战，迫切需要研发新型抗生素替代品来防治水产养殖动物细菌性疾病。表1总结了国内外关于噬菌体疗法在海水养殖动物中的应用研究，以期为噬菌体控制海水养殖动物细菌性疾病提供参考。

3.1 节肢动物养殖中的噬菌体治疗

近些年，许多养殖节肢动物的疾病频繁爆发，使得养殖业蒙受了巨大的损失。其中弧菌病是造成对虾养殖业经济损失最严重的致病菌，死亡率为100%[14]。由副溶血性弧菌引起的急性肝胰坏死病一直是东南亚和拉丁美洲对虾养殖业中最严重的疾病之一。Jun等[15]研究噬菌体治疗急性肝胰坏死病的效果，发现采用噬菌体pVp-1防治感染副溶血性弧菌的南美白对虾(Penaeus vannamei)急性肝胰坏死病具有显著保护效果，并提高存活率。噬菌体喂养法治疗组累计死亡率为50%，浸浴法治疗组累计死亡率为25%和50%。且发现pVp-1的预防性比治疗性更好。Lomelí-Ortega等[16]发现，选择裂解性噬菌体(A3S和Vpms1)能有效降低由副溶血性弧菌引起的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的死亡率，低感染复数( MOI＜0.1) 就足以杀死副溶血性弧菌，并且在感染6 h内注射噬菌体可避免对虾的死亡。如若在感染6 h后再进行治疗，则会降低存活率，影响治疗效果。胡蝶等[17]采用复相乳液法，对副溶血弧菌噬菌体(PI)进行固定，制备噬菌体微胶囊。将质量分数为1 g/kg的噬菌体添加到饲料中，并投喂凡纳滨对虾，对虾肠道的宿主菌比对照组减少86%，水体中的宿主菌减少68%(P＜0.05)。

哈维弧菌是发光的海洋细菌，可引起对虾的发光病。且由于哈维弧菌可形成生物膜，导致抗生素的治疗效果降低。Karunasagar 等[18]研究了噬菌体Viha10和Viha8治疗由哈维弧菌引起的斑节对虾(Penaeus monodon)发光病的效果。结果发现，噬菌体的治疗效果优于抗生素。注射噬菌体治疗的斑节对虾存活率分别为88% ( Viha10) 和86%( Viha8) ，而注射氧四环素和卡那霉素的斑节对虾存活率分别为68%和65%(P＜0.05)。Viha10和Viha8对哈维弧菌的裂解效果分别为70%和68%，但将这两种噬菌体混合使用，裂解效果可达到94%。Vinod 等[19]也试着用噬菌体治疗斑节对虾的发光病。结果发现，在17 d的试验周期内，空白对照组的斑节对虾存活率为17%，噬菌体治疗组(200 ppm/d)平均存活率高达86%，与抗生素治疗组40%的存活率相比，噬菌体治疗具有显著优势，并且随着噬菌体使用浓度的提高，斑节对虾的存活率也有明显上升趋势。

3.2 软体动物养殖中的噬菌体治疗

弧菌致病菌给养殖业带来巨大的经济损失，对海水规模化养殖的发展造成了巨大的威胁。此类致病菌对方斑东风螺，皱纹盘鲍以及牡蛎的致病性很强。

胡蝶等[17]以质量分数为1 g/kg的噬菌体添加到饲料中投喂方斑东风螺(Babylonia areolata) 。与对照组相比，东风螺肠道宿主菌平均减少96%(P＜0.05)，水体中宿主菌减少72%(P＜0.05)。可见微胶囊可有效控制宿主弧菌在养殖体系中的浓度，减少养殖动物弧菌病的发生。柏仕杰等认为水体中存在一定浓度的噬菌体，可使宿主弧菌浓度持续下降到一个较低浓度，并可持续控制较长时间，从而大幅度的减少养殖动物弧菌病的爆发。

李太武等[20]用噬菌体对河流弧菌II(V. fluvialis-II)导致的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)脓疱病进行了防治研究。结果表明，使用一定浓度的噬菌体可以有效地治疗或推迟脓疱病引起的盘鲍死亡，可将盘鲍的成活率提高50%以上。

荣蓉等[21]将噬菌体VPp1用于牡蛎(Concha ostreae)体内副溶血弧菌的净化，结果发现，噬菌体添加浓度MOI值为0.1条件下，经过36h的净化，可使牡蛎体内的副溶血弧菌数量降低2.35～2.76 log CFU/g。同样条件应用于工厂化规模，可使牡蛎体内的副溶血弧菌数量降低1.11log CFU/g，另外对于牡蛎体内的其他海洋性弧菌的增值也起到了抑制作用。与此类似，牡蛎养殖水体中添加噬菌体qdvp001后确实对养殖牡蛎环境中的副溶血弧菌具有裂解作用，可使添加浓度为1.0×108cfu/mL和1.0×106cfu/mL的副溶血弧菌浓度分别下降5个和3个数量级。与未添加噬菌体的对照组比较，可发现添加噬菌体后牡蛎体内的副溶血弧菌数量明显降低，所以对牡蛎副溶血弧菌病的预防起着积极的作用[22]。

3.3 棘皮动物养殖中的噬菌体治疗

腐皮综合症已成为刺参(Apostichopus japonicus)养殖业最常见、危害最严重的疾病，严重制约了刺参养殖业的发展。幼参和成参均可被感染，其中幼参的发病率高达90%以上。2003-2005年，由刺参腐皮综合症引起的经济损失额高达20亿元，这引起了广大学者的高度重视[23]。

Zhang等[24]从一家水产市场的排水管中筛选出对溶藻弧菌(V. alginolyticus)Z1210敏感的噬菌体PVA1和PVA2，并制备成噬菌体鸡尾酒，浓度分别为105、106、107PFU/mL。刺参通过浸泡法给药，结果发现空白对照组存活率为3%，噬菌体浸浴组存活率分别为47%(105PFU/mL)、50%(106PFU/mL)和73%(107PFU/mL)。与使用抗生素5 mg/L的强力霉素组存活率80%和10 mg/L的卡那霉素组存活率47%相比，无显著差异。

杨扬[25]从患腐皮综合征的刺参(Apostichopus japonicus)组织中分离获得1株嗜环弧菌(V.cyclitrophicus)和1株塔斯马尼亚弧菌(V.tasmaniensis)，并筛选出其对应的裂解性噬菌体PVDL-1和PVDL-2。PVDL-1噬菌体潜伏期约为35 min，裂解量约为218 PFU/cell，可将刺参存活率由45%提高到90%；PVDL-2噬菌体潜伏期约为30 min，裂解量约为110 PFU/cell，预防性和治疗性实验组可将刺参存活率从0%分别提高到95%和55%。噬菌体添加量越多治疗效果越好。其中感染复数为10时，接近抗生素组的治疗效果。

Li 等[26]在刺参养殖池水中筛选出对嗜环弧菌的噬菌体Vc1，并采用口服和注射两种方式研究不同的给药方式对噬菌体抑菌效果的影响。实验结果表明，投喂含噬菌体的饵料60 d后，刺参存活率为81%，与对照组相比刺参存活率提高了63%; 然而注射噬菌体给药后，刺参的存活率只有58%。结果显示，对于刺参而言，口服的方式更有利于噬菌体抑菌效果的发挥。

3.4 脊索动物养殖中的噬菌体治疗

Nanna等[27]发现在大西洋鳕鱼(Gadus morhua)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼苗养殖中使用广谱噬菌体KVP40控制四种不同鳗弧菌(V. anguillarum)引起的细菌性疾病，可有效降低幼鱼的死亡率。添加噬菌体KVP40对大菱鲆幼鱼的存活率有显著增加。其中对菌株4299的处理组效果最为显著，在8d的实验中，大菱鲆幼苗死亡率始终低于66%。与攻毒后不使用噬菌体组相比，大菱鲆幼鱼死亡率平均下降36%(P＜0.05)。在大西洋鳕鱼养殖实验中，噬菌体KVP40控制PF7鳗弧菌，死亡率可降低75%。实验还证明了噬菌体KVP40对鱼卵孵化时期的未知细菌也具有控制效果。

表1 海水动物养殖业中的噬菌体研究

Nakai 等[28]筛选出多株格乳球菌(Lactococcus garvieae)的特异裂解性噬菌体，主要可分为PLgY和PLgW系列。大部分噬菌体的潜伏期在1 h，5 h 后噬菌体效价达到最高( 1010pfu /mL) 。通过腹腔注射和口服两种方式研究了噬菌体对病鱼的治疗作用。结果显示，腹腔注射组存活率( 100%，n=20) 高于对照组存活率( 10%，n=20) ，且在感染格氏乳球菌后的不同时间段内给药，存活率也均有显著差异。口服治疗组与对照组相比，黄尾鲱鱼(Seriola quinqueradiata)的死亡率显著降低，且在口服给药3～48 h 内，在黄尾鲱鱼的肠道及脾脏中可检测到噬菌体的存在，最高效价达到106pfu /g。该研究表明，格式乳球菌的特异裂解性噬菌体可有效地杀灭宿主菌并可抑制其增殖，从而达到保护水产养殖对象的目的，并且确定了噬菌体最佳治疗时间，在实际应用中具有重要指导意义。

Verner-Jeffreys等[29]将噬菌体O, R和B制备成混合制剂(1.9×108pfu/尾)，对大西洋鲑鱼(Salmosalar)进行腹腔注射，可有效延缓由杀鲑气单胞菌(78027)(Aeromonas salmonicida)引起的大西洋鲑鱼的死亡速率。攻毒后立即注射噬菌体组鱼的死亡速度明显慢于未使用噬菌体处理或在24 h后注射噬菌体组。但最终结果(死亡率100%)未受影响。

Silva等[30]筛选出杀鲑气单胞菌的噬菌体AS-A。噬菌体治疗实验中，通过浸浴的方式给药，72 h后对照组累计死亡率达到36%，而实验组累计死亡率为0%。该结果显示噬菌体浸浴给药后塞内加尔鳎幼鱼(Solea senegalensis)对致病菌的抗性显著提高。还发现，在宿主细菌存在的情况下添加噬菌体，差异并不显著。因此，噬菌体在幼鱼生长过程中，可有效且安全地预防疖疮病。

4 噬菌体治疗面临的挑战

目前,不管是在临床研究，还是在陆地动物和鱼类等的疾病防治中，噬菌体疗法仍有如下一些问题。

(1)并非所有噬菌体均可以用于治疗。治疗性噬菌体应具有较好的抗菌活性，并且具有较低的毒性，并确定不存在不需要的基因如毒素基因。且溶原性噬菌体不适合用于噬菌体治疗。

(2)噬菌体的宿主专一性，导致狭窄的噬菌谱。如细菌对某些噬菌体类型产生耐药性，可降低噬菌体与细菌间特异性吸附过程，从而降低治疗效果。但这一问题可以通过使用噬菌体鸡尾酒法来解决。

(3)噬菌体作为药物是基于其活性蛋白，这可以与体内免疫系统发生相互作用。也可在体内复制，甚至会在使用过程中不断进化。

5 小结

噬菌体疗法虽然在鱼类模拟养殖中取得了一定的疗效，但目前大规模用于细菌感染的防治尚不成熟，有关噬菌体的各种研究正在展开。作为抗菌药，噬菌体具有多种性质，使其成为化学抗生素的有力替代品，而可用于治疗的噬菌体都应具有有效配方和更多的临床实验以及详细的噬菌体制剂应用方法。与早期的噬菌体治疗相比，目前对噬菌体有了更深入的了解。这给噬菌体治疗带来了二次发展的机会。