胡椒亭作为一种抗肿瘤药物的先导化合物合成及类似物的性质

赵诗佳 编译，徐志 审校

(1 武汉科技大学化工学院，武汉 430080；2 湖北德信辰科技有限公司，武汉 430080)

1 胡椒亭作为抗癌药物

胡椒亭也叫荜拨亭，是一种阿育吠陀属药用植物—荜茇(长胡椒)的酰胺生物碱（图1）。这种酰胺生物碱于1961年首次被分离出来。而其分子结构则于1984年才测定出来。尽管在几十年前被发现，但胡椒亭的药理特性还没有得到深入的研究。前几年这个分子的各种生物活性被发现，其中包括抗血小板，抗接种，抗焦虑性，抗抑郁，神经保护，抗动脉硬化，抗菌作用，尤其是抗癌特性。2000年至2007年间，在Laborato"国立奥科洛康实验和Universaldo Cara大学"进行的5166分子筛选抗肿瘤药物的研究中被证实胡椒亭是潜在的抗癌药物。

对胡椒亭的抗肿瘤活性的研究中，几个癌症模型显示了对多种癌细胞株的细胞毒性和抑制作用，包括：结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌和前列腺癌。此外，在各种动物模型中也发现了抗肿瘤活性。胡椒亭通过使细胞凋亡和坏死触发细胞死亡。胡椒亭活性的分子凋亡作用包括：细胞淋巴瘤的减少、以及半胱天冬酶-3、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的活化、癌基因以及NH2-端激酶的激活有关。此外，胡椒亭被发现可以使人类结肠癌细胞株中突变的p53蛋白质恢复正常功能，胡椒亭同时也能通过自噬来诱导细胞死亡。

图1 荜茇酰胺结构

胡椒亭的抗癌特性通常与其对谷硫酮s转移酶π(GSTπ)和羰基还原酶(CBR1 1)的抑制有关，同时会破坏体内氧化还原平衡并在癌细胞中产生活性(ROS)。此外，活性氧-独立的运动目标(如核输出或PI3K/Akt/mTOR抑制)也被认为是其抗癌特性的相关因素。

除了上述的抗癌特性外，胡椒亭也被发现具有抗侵入性。它能够抑制高度转移性的人类神经胶质瘤LN229和 U87 MG 细胞在划痕伤实验模型中的迁移。它也被发现能抑制扭转蛋白和N-钙粘蛋白的表达，而这两种蛋白是癌症转移所必须的组分，同时具有破坏p120-ctn/vimentin/N-cadherin复合体细胞转移的能力。在高度转移性前列腺癌细胞中，胡椒亭减少了细胞的入侵及IL-6，IL-8，MMP-9和ICAM-1的表达，其中ICAM-1是一种细胞间粘附蛋白，另外也证实了胡椒亭的抗血管生成特性，这是由VEGF蛋白质水平的降低所调节的。

胡椒亭与其他化学疗法相结合，显示出了令人兴奋的特性，具有提高5-氟二氧嘧啶、顺铂、阿霉素、紫杉醇和姜黄素的活性。胡椒亭，在非细胞毒素的作用下，增强了MDA-MB-231细胞的辐射灵敏度，这可能与其对细胞凋亡相关表达蛋白的调控和细胞内活性氧水平的升高有关，从而增加辐射诱导细胞凋亡。

胡椒亭的药理活性具有较高的选择性，不影响对肿瘤细胞毒性较高的健康细胞。此外，体内毒理学实验表明，胡椒亭非常安全，并且它能够被肠胃大量吸收，在老鼠身上，经口服给药后，该分子的生物利用率为50 %～76 %。

大量关于胡椒亭活性的研究报告表明，针对在癌症发展的不同阶段中作为关键分子靶点，以及低毒性和有益的药物动力学特性，使这种分子在未来抗癌治疗中具有极大的潜在应用前景。然而，由于难以达到纳米级和低水溶性，其应用能力是很有限的。药物化学家可能有望合成一种具有更好的抗癌活性和具有药物类物理化学参数的胡椒亭类似物化合物。本文介绍了最近发表的关于胡椒亭类似物的合成及其抗癌结构和活性关系的研究。

2 胡椒亭及其类似物的结构活性研究

2.1 亲电性和活性

胡椒亭结构包含两个Michael受体，即2,3-和7,8-不饱和键，在多项胡椒亭化合物活性的研究中。Adams等获得了两个饱和衍生物-1和2（图2）。两者均显示，对H1703和HeLa细胞株的毒性降低，而衍生物1未能增加细胞内活性氧水平，衍生物2显示的药物活性低于胡椒亭。其他研究小组发现，1和2的细胞毒性和产生活性氧的特性均有所下降。这些化合物还具有对GST较低的抑制活性，而2,3-和7-8-饱和化合物(3)则完全不能抑制该酶。

在药物活性分子中，烯烃的存在，及其亲电性都很重要。Wang等证明分子的亲电性与抑制性之间存在着Cor关系(R=0.85)，以及GST的抑制作用。因此，空间封锁(4)和环化(5，6)降低了这些中心的反应活性，进一步降低了化合物的活性。增加亲电性主要是通过用氯原子(7)取代乳胶环，或用碳原子(8)取代内酰胺的氮来实现的。然而，最有效的方法可以通过在芳香环上引入一个三氟甲基喹啉。因此，在抑制GST活性方面，最有效的分子是具有三氟甲基喹啉和2-氯(9)的化合物。

烯烃在胡椒亭与GST的结合中所起的关键作用非常重要。研究表明，胡椒亭的7，8-烯烃与GST活性部位的硫酰基相互作用，而2,3-烯烃与谷硫酮相互作用。Harshbarger等研究胡椒亭和谷胱甘肽共结晶的GSTP1的X射线晶体结构，发现不是胡椒亭与其作用，而是其水解共轭产物谷胱甘肽结合酶。研究者指出，胡椒亭首先经历了2,3-烯烃与胞内硫醇的结合，从而使分子不稳定。这样，就会发生HY-水解反应，而这个反应的产物则是7,8-烯烃和谷硫酮结合物。这种复合物才是酶的真正抑制剂。这些结果表明，从GST抑制的角度来看，胡椒亭是一种前药，它的2,3-烯烃在分子激活中起着重要作用，而7,8-烯烃在谷硫酮复合物的生成过程中起着重要作用。这种化合物能够抑制酶。还需要进一步研究确定谷硫酮的水解和结合是否影响其衍生物的抗癌活性，并在其他目标分子机制中的作用。

2.2 芳香环及其活性

图2 哌隆胺修饰对烯烃亲电性的影响

图3 芳香环中修饰的哌隆胺类似物

缺少芳香环结构(10，图3)的胡椒亭降低了对GST的抑制，同时也降低了对癌细胞的细胞毒性。在芳香族和7-8-烯烃(5,6)之间的环化过程中，得到了类似的结果。han等发现用芳香族杂环代替苯环，即吡啶或呋喃，不会改变抗癌性能。然而，Zou等研究了9种吡啶、吡嗪和喹诺类药物的合成，显示对结肠癌细胞系的抗增殖活性增加。最活跃的一种，活性最高的化合物-喹啉-2-基衍生物(11)及其2-氯类似物(12)的IC50值小于1 μmol/L。衍生物12还能诱导细胞产生活性氧并抑制肿瘤生长。所有得到的衍生物都具有较好的水溶性。

正如Adams等所描述的，去除甲氧基基团不会导致药物细胞毒性或活性氧的显著升高。Meegan等合成的芳香环哌啶酮，分别被单甲氧基、二甲氧基和三甲氧基取代。细胞毒性最大的是2'4'5-三甲氧基衍生物(13)，可与未取代芳香环的衍生物媲美，但其活性低于胡椒碱。化合物13选择性较弱(MCF-7对MCF-10a)，其活性可被抗氧化剂逆转。这些结果表明，苯的甲氧基取代物不是药物活性的最佳选择，其他改变可以提高抗癌性能。在此基础上，研究了芳香环的吸电子效应对活性的影响。2'位处的氯取代(14)活性略有降低。4'-溴(15)和2' ，6'-二氯(16)衍生物的活性也比胡椒碱的活性低，而4'-氟-3'-甲氧基(17)的类似物的活性提高。如前所述，三氟甲基基团(特别是在4'位)能有效地增强药物的作用。4'-硝基取代化合物(18)也被发现略有提高药物活性。到目前为止，研究还没有完全确定吸电子基团对去核性质的影响。但是，强吸电子基团(-CF3，-NO2)可能优于弱吸电子基团(例如卤化物)。

2.3 内酰胺环修正

如前所述，内酰胺的2,3-烯烃和它的亲电性，在胡椒亭细胞毒性和ROS28的上升中起关键作用。因此，对这部分分子的修饰可能会对衍生物活性产生很大的影响。有意思的是，用氮环庚三烯或四氢氮杂酮替代二氢吡啶酮对细胞毒性的影响很小。

研究发现，取代C2和C3原子会显著影响哌隆胺的活性。2-甲基(19，图4)、3-甲基(20)或2-苯基(21)取代完全破坏了细胞毒性，而含有2-(2-氟苯基)-1-炔(22)或2-环丙基螺-1-炔(23)明显增加了细胞活性。2-吗啡啉取代降低了胡椒亭及其一系列7-烷基衍生物的活性。将2位引入吸电子基氯原子，可以明显提高化合物对GST的抑制性能，但只针对那些芳香环由一个三氟甲基乙酯基团取代的基团。2-氯(7)替代物可提高细胞毒性和活性氧生成能力，抑制硫氧还蛋白还原酶，增强细胞凋亡，抑制细胞周期。2-氯哌隆能诱导细胞凋亡，使细胞周期阻滞于S期。2-氯取代还提高了7-烷基衍生物(下文所述)的活性。

Lad等描述了一系列胡椒亭磺酰胺类化合物的合成和生物评价。其中内酰胺羰基被一种砜基所取代。此外，被测化合物在芳香环上具有不同的取代基。其中几种化合物在磺酰罗丹明B测定中显示出较强的活性。有意思的是，最活跃的是2-甲氧基，3'，5'-二甲氧基，以及3'-氟取代，显示的GI50值小于0.1 μmol/L。因此，磺胺取代羰基基团的引入会导致药物特性的显著变化，为新型衍生物的开发提供了一个好的研究方向。

其他C4和C5取代衍生物没有被广泛的研究，但其显示出差不多或低于胡椒亭的细胞毒性。

2.4 7-取代基

图4 哌拉西林内酰胺环的修饰

7，8-烯烃在胡椒亭的活性中起着重要的作用。在之前的研究中，该结构是修改后形成三个衍生物：分别是将其移除，被环丙烷取代和被一个三键取代。虽然前两种衍生物的活性显著降低，但引入三键大大提高了药物的细胞毒性。第7号位置也被用来引入新官能团。

Punganuru等获得了一系列7-芳基胡椒亭衍生物作为微管不稳定因子。这种替换的想法来自于combretastatin-A(25，图5)的结构，这是一种著名的微管靶向药物，与具有强细胞毒性和抗血管生成作用的药物秋水仙碱结合在一起。甲基(26)取代7-苯基，甲氧基(27)，甲巯基(28)，乙氧基(29)组和氟代基(30)或氟基(31)。其中，最具细胞毒性的是化合物27，其次是化合物29，达到IC50值小于1 μmol/L的化合物，化合物27具有生成活性氧和诱导蛋白质谷胱甘肽化的特性，并且类似于胡椒亭具有恢复突变p53蛋白质的功能的能力。最后，化合物27能有效地破坏微管的稳定，使细胞周期阻滞在G2/M期，并诱导细胞凋亡。为了确定7-芳基取代物和烷氧基在上述化合物的活性，还需要进一步的研究。

Wu等获得了一系列胡椒亭的7-烷基衍生物。然而，这种方法并没有显著改变细胞毒性，7-烷基衍生物，特别是2-氯胡椒亭的7-甲基衍生物(32)，显示出更强的细胞毒性。复合物32是一个ROS诱导剂，对肿瘤生长的抑制作用大于胡椒亭(48.58 %和38.31 %)。

2.5 齐聚共轭

以芳香环为原料，合成了胡椒亭低聚物和含有抗癌分子结构元素特征的杂合化合物，这是一种有效获得两种物质属性的化合物的方法。

Adams等合成了4-(二甲氨基)乙基单体(33，图6)，以及由氨基乙基连接的类似于二聚体(34)和三聚体(35)。这种方法使细胞毒性和细胞内活性氧产生显著的增加：二聚体的效力是单体的10倍，而三聚体的能力是二倍体的2倍。化合物34被发现在纳米-摩尔浓度下对肾癌细胞系有很强的作用，而抗氧化治疗则逆转细胞毒性。化合物34抑制了PNX0010(患者衍生肾细胞癌)异种移植肿瘤的生长比胡椒亭更有效。

图5 苦味素- a及其7取代衍生物

图6 哌隆胺单体，二聚体和三聚体

图7 胡椒碱共轭物

Liao等试图通过将胡椒亭与组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂-vor-inosta(36)联合处理AML(急性髓系白血病)细胞，从而提高细胞毒性。药物之间的协同作用有助于形成这些药剂化合物。化合物(37)对白血病细胞株有显著的细胞毒性，导致细胞凋亡和DNA损伤。化合物37还表现出了独特的胡椒亭特性：抗氧化处理可保护细胞免受细胞毒性干扰，且与谷胱甘肽结合，维持HDAC的抑制作用。在C2位置引入氯原子，增加了药物的活性，但是减少了选择性。与消除了7，8-烯烃的其他衍生物一样，缺少这种Michael受体的化合物活性较低。

通过取代具有6, 7和8取代的4-羟基香豆素的苯环，得到一个双香豆素结构(38)的片段，获得了一系列细胞毒性剂。双香豆素是一种具有药物敏感性和细胞毒性的植物成分。因此，药物的组合有望产生具有更高抗癌性能的化合物。甲氧基、甲基、卤化物衍生物是中度的细胞毒性物质。最活跃的是7-氟化合物(39)，可提高A 549细胞的活性氧水平，诱导细胞凋亡，改善细胞的理化性质。当对人类肺部癌症的异种移植进行治疗时，化合物39抑制肿瘤生长，类似于胡椒亭(48.46 %和41.23 %)。

2.6 胡椒亭作金属结合剂

金属配合物在癌症治疗中应用比较早，目前正受到深入的研究。以胡椒亭为螯合剂的研究是由D'Sousa Costa等(2017年)进行的，他们使用胡椒亭作为复杂钌螯合物的配体。在3D模型中，所获得的两种化合物对广谱癌细胞的杀伤活性均比无金属胡椒亭高2～12倍。这些化合物在最敏感的HTC116结肠癌细胞系中，诱导半胱胺酸天冬氨酸-3和线粒体发生内在细胞凋亡，DNA断裂和活性氧生成。Fang等(2018年)研究了用吡咯烷酮代替二氢吡咯酮环合成胡椒亭类似物，该环被表征为铜(Cu2+)螯合物，它作为Cu2+离子载体，显示可增加HepG 2细胞内铜的浓度，尤其是Cu+，从而引起氧化还原失衡、凋亡和坏死。

3 合成

Boll等率先发现了胡椒亭合成方法，他使用了3,4,5-三甲氧基肉桂酸酸酐和5,6-二氢吡啶-2(1 H)-1在甲苯和吡啶中的反应(5.66 %)。目前，胡椒亭和它的类似物以类似的方式合成，通过在羧酸衍生物和适当的取代(α,β-不饱和键)δ内酰胺之间的酰胺键形成。常见的一种方法是在四氢呋喃(THF，78 ℃)中对n-丁基锂(n-BuLi)转化为去质子化内酰胺，然后将其与吡咯酰基或草酰氯活化的酸偶联，形成混合酸酐。另一种方法是用酸性氯化物对不饱和环酰胺进行N-酰化反应。这一反应可在THF中与氢化钠加成，或与三乙胺加成。如果在酰氯的N-酰化反应中使用饱和内酰胺（例如哌啶-2-酮，吡咯烷-2-酮），则可将试剂在甲苯中回流数小时或在二氯甲烷中混合并加入三甲胺。为了获得C2-C3不饱和键，需要对化合物进行进一步的反应，例如，用苯硒酰氯生成硒衍生物，然后用过氧化氢氧化。Han等使用了Horner-Wadsworth-Emmons型试剂(对应的5，6-二氢吡啶-2(1H)-酮的N-膦酰乙酰基衍生物，例如，二(2 -氧代- 2 -(6 -氧代二氢吡啶类1 3(2H)基)乙基]膦酸)在0 ℃和氢化钠存在下，在四氢呋喃中与适当的醛反应至室温，该试剂的合成是一个多步骤的过程，采用商用的δ-戊丙酰胺(哌啶-2-1)作为起始底物，该方法是合成苯环类似物的一种方法，它不需要合成取代肉桂酸盐，合成具有取代肉桂酸酯的化合物，以吡啶或呋喃取代苯基的其他芳基组分（图8）。

一些研究指出，在胡椒碱合成路线中（图9），主要的挑战是制备适当取代的5,6-二氢吡啶-2(1 H)-1，这种化合物经常是在适当的酰胺的转位反应中合成，它具有烯键，例如N-(叔丁基-3-烯-1-基)-2-烯胺。在这个过程中，Grubbs第二代催化剂经常被使用。同样，为了获得胡椒亭衍生的环磺酰胺，用Grubbs的第二代催化剂合成了环N-(但-3-烯-1-基)乙烯磺酰胺，在2-氯取代胡椒亭衍生物的合成中，使用了3-氯-5，6-二氢吡啶-2(1H)-酮，由哌啶酮-2-酮与五氯化磷反应得到的底物为3，3-二氯哌啶-2-酮，随后进行脱氢卤化。

混合酸酐方法(通过piv-aloyl或草酸激活的酸)不仅能获得简单的类似物，还能获得其他物质，包括混合化合物，结合了胡椒亭与一种著名的HDAC抑制剂-vorinostat的结构，在一系列报道中，在哌啶的4'位引入了一种连接到羟肟酸基的7种碳连接剂。在2位上用烷基、芳基或烷基芳基代替2位的胡椒亭类似物，可以通过选择性碘化反应来合成2位和钯催化交叉偶联，在4'位上，与氧和二乙烯胺类结合相类似，从1-3-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯)得到1-2-2-2(1 H)-1-1-2-甲基二乙醇胺-2-甲基二乙醇胺，或三乙醇胺，在甲苯和THF中进行，添加了三苯基磷化氢和(E)-二异丙基。

图8 哌替啶衍生物合成的一般方法

图9 5,6-二氢吡啶-2(1H)- 1 (a)及其磺胺类似物(b)

4 结论

胡椒亭类似物的合成，可以用于获得理想的天然药物化合物的衍生物。这个概念早期被广泛用于很多药物的开发，并且用于治疗各种疾病。

根据目前的文献，已经确定了几种常见的结构-活性关系（图10）。这表明2，3-烯烃的存在是必要的，而7，8-烯烃有利于复合物的活性。在所有的研究中，发现2-氯取代，可能是通过增加2,3-烯烃的选择性，来提高活性的。尽管2-氯取代并没有得到深入的研究，但是对于研究其他的官能团非常有参考价值。活性的另一个要求是芳香环，然而，原始的苯基可能是成功地用其他的芳香烃代替，并被其他的甲氧基取代。具有特别强的吸电子性能的基团是最先被取代。内酰胺环也可能会被取代。关于4-取代的数据非常有限，而5-和8-取代需要去研究。这也可能是未来研究的一个有吸引力的方向。

通过与其他抗癌分子杂合的胡椒亭杂合体，取得了非常有意思的结果。这种方法显著提高了药物活性，然而，还需要进一步研究这一混合物的毒性和动力学问题。

近年来合成的胡椒亭类似物在体内外均表现出良好的活性。然而，关于这些化合物的物理化学性质，特别是水溶性、安全性和药代动力学- ADME参数方面的信息还很缺乏。未来有必要研究这些问题，因为它们对药物开发过程中的药理活性同样重要。胡椒亭被发现具有广谱的抗癌特性，然而，有关胡椒亭类似物的合成研究，主要集中在其细胞毒性，在某些情况下，会研究其促氧化和抗肿瘤的性质得到的衍生物，未来还应该探索更多的细胞毒性胡椒亭类似物，研究它们是否具有同样良好的促凋亡、抗侵袭和抗血管生成作用。同时，由于哌隆胺具有良好的抗癌和抗逆转作用，因此其分子靶点也应引起人们的重视。

图10 哌隆胺修饰的主要概念及构效关系

未来还应该探索更多的细胞毒性胡椒亭类似物，研究它们是否具有同样良好的促凋亡、抗侵袭和抗血管生成作用。同时，由于哌隆胺具有良好的抗癌和抗逆转作用，因此其分子靶点也应引起人们的重视。

近年来，胡椒亭活性的优化研究取得了很大的进展，但随着细胞毒性的增加，胡椒亭的理化参数、药代动力学和安全性的优化必须得到更多的关注。