PAX1甲基化与蛋白检测在宫颈鳞癌及上皮内病变中的应用价值分析

阮 颖，郑 洪，刘华庆，黄佳佳，谭 娜，王 凯

(遵义医科大学附属医院 病理科，贵州 遵义 563099)

宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一[1]。我国宫颈癌发病率15/10万，近年来发病趋势明显年轻化，且早期患者增多[2]。随着医学分子技术的发展以及对表观遗传学的重视，发现抑癌基因的异常甲基化可导致目的基因及调控基因的转录失活，促进肿瘤的发生[3]。配对盒家族基因 1(Paired box gene 1，PAX1)是一种重要的抑癌基因，PAX1 甲基化抑制細胞分化，可影响宫颈癌前病变的病理进程[4]。PAX1蛋白是一类非常保守的转录因子，它在机体发育和疾病中有着重要的作用[5]。然而，少有文献对PAX1甲基化与蛋白表达在宫颈鳞癌及上皮内病变的临床病理学意义进行报道，本研究旨在分析PAX1甲基化与其蛋白检测在宫颈鳞癌及上皮内病变中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本 收集遵义医科大学附属医院病理科2014年1月至2018 年 10月存档的320例宫颈病变患者石蜡标本。根据病理诊断结果将其分为慢性宫颈炎症(组Ⅰ，93 例)、低级别鳞状上皮内病变(组Ⅱ， 20 例)，高级别鳞状上皮内病变(组Ⅲ， 112 例)及宫颈鳞癌(组Ⅳ，95例)。鳞癌组标本包括Ⅰ期73例，Ⅱ期22例；按病理分型：角化型54例，非角化型41例；按淋巴结转移分为：阳性27例，阴性68例；按有无复发分为：阳性7例，阴性88例。以上标本术前均未曾行放疗、化疗及免疫治疗，所有活检标本均经10%的中性福尔马林液固定，切片HE染色后由专业病理医师参照2014年WHO诊断标准进行诊断[6]。

1.2 研究方法

1.2.1 PAX1甲基化检测 首先提取石蜡样本DNA，用亚硫酸氢盐转化后的DNA(BisDNA)，进行PCR扩增，采用实时荧光定量PCR仪检测PAX1甲基化状态做定性分析， 严格按照试剂盒说明书操作并进行判读。阳性判读标准：目的基因CT值≤ 20情况下，目的基因CT值<内标基因CT值，或者内标基因无扩增曲线；目的基因CT值>内标基因CT值 ，△CT≤4。阴性判读标准：目的基因无扩增曲线，或者目的基因CT值>内标基因CT值，且△CT>4(△CT=目的基因CT值-内标基因CT值)。 PAX1甲基化上游引物，5'-GCGGTGATAGTGGTTGAGGAG-3'，PAX1非甲基化上游引物，5'-GTGGTGATAGTGGTTGAGGAGTATATG-3'，PAX1甲基化下游引物，5'-GGAGTGATTGGTTTATAATTTTTGG-3'，PAX1甲基化探针，FAM-CGGAGGTTTCGATTTT TTTGTTTTCGTT-BHQ1，PAX1非甲基化探针，VIC-GGTTGTGGAGGTTTTGATTTTTT TGTTTTTG-BHQ2。反应体系：10 μL甲基化MIX+5 μL引物探针混合液+5 μL BisDNA=20 μL总量。反应条件：第一步95℃ 5 min，循环1次；第二步95℃ 15 s，66℃ 30 s，各循环20次；第三步95℃ 10 s，62℃ 31 s，各循环40次，最后收集荧光信号。

1.2.2 PAX1蛋白检测 PAX1抗体购于英国 Abcam公司，参照说明书选取人胃癌石蜡组织作阳性对照预实验，获得PAX1一抗的最适浓度比例为1∶200，运用免疫组织化学Envision法检测，采用柠檬酸钠缓冲液高压锅修复，操作步骤按说明书进行。PBS缓冲液代替一抗作空白对照。结果判定：PAX1蛋白的表达位于细胞核，以胞核染成黄棕色或黄褐色均匀颗粒状为阳性细胞。 参照同类PAX蛋白判读标准[7]，高倍显微镜下随机选取5个视野，其中细胞核内无着色计0分、细胞核内见浅黄色颗粒计 1 分、细胞核内见棕黄色颗粒计2分、细胞核内见棕褐色颗粒计3分；染色细胞比例不足10%计0分 、10%～25%计1分 、>25%～50%计2分、>50%计3分，以细胞核着色强度、染色细胞比例乘积>3分为阳性表达。

1.3 统计学处理 采用 SPSS 18.0 软件进行数据统计分析，计数资料采用χ2检验及Fisher确切概率法，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 4组患者PAX1甲基化水平比较 本次研究采用实时荧光定量PCR仪作甲基化定性分析，其4组的部分样本PAX1甲基化扩增曲线(见图1)。宫颈组织的甲基化率随病变程度的加重而增高，鳞癌组最高，4组比较差异显著。进行组间两两对比显示，鳞癌组、高级别、低级别鳞状上皮内病变组分别与慢性炎症组差异明显；鳞癌组、高级别与低级别鳞状上皮内病变组差异具有统计学意义；鳞癌组与高级别鳞状上皮内病变组也具有统计学差异(见表1)。

A：组Ⅰ；B：组Ⅱ；C：组Ⅲ；D：组Ⅳ。图1 4组部分样本PAX1甲基化qRT-PCR扩增曲线

表1PAX1甲基化检测在宫颈组织中的甲基化率情况 (n，%)

组别例数甲基化例数 (%)χ2P慢性炎症931(1.08)低级别鳞状上皮内病变 205(25.00)∗164.673<0.001高级别鳞状上皮内病变11274(66.07)∗#鳞癌9585(89.47)∗#&

两两比较时经矫正检验水准α’=0.05/[k(k-1)/2]≈0.008，k为比较组数，*：本组与慢性炎症组比较P<0.008，#：本组与低级别鳞状上皮内病变组比较P<0.008，&：本组与高级别鳞状上皮内病变组比较P<0.008。

2.2 PAX1甲基化率与临床病理特征的关系 在宫颈鳞癌组织中，PAX1甲基化率与患者年龄、病理分型、有无淋巴结转移无关，差异无统计学意义(P>0.05)，但与患者复发相关，差异具有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2PAX1甲基化率在宫颈鳞癌组织中的甲基化情况与临床及病理参数的比较(n)

临床病理特征例数阳性阴性χ2 P 年龄≤50 635580.3770.539>50 32302病理分型角化型544770.3030.582非角化型41383淋巴结转移无686170.0001.000有27243有无复发无88817-0.024∗有743

*：为Fisher确切概率法的结果。

2.3 4组患者PAX1蛋白表达情况比较 PAX1蛋白在慢性宫颈炎组织中低表达，随着宫颈病变程度的加深，表达逐渐增强(见图2)。宫颈高级别鳞状上皮内病变组PAX1蛋白阳性表达率最高，然而鳞癌组表达率有所降低，4组比较差异有统计学意义。进行组间两两对比显示，鳞癌组、高级别鳞状上皮内病变组、低级别鳞状上皮内病变组与慢性炎症组差异明显，高级别鳞状上皮内病变组与低级别鳞状上皮内病变组具有统计学差异(见表3)。

A：组Ⅰ； B：组Ⅱ；C：组Ⅲ；D：组Ⅳ；SP，×400。图2 4组患者 PAX1 蛋白表达

表3PAX1蛋白检测在宫颈组织中的阳性表达情况(n，%)

组别总例数阳性例数 (%)χ2P慢性炎症931(1.08)低级别鳞状上皮内病变2014(70.00)∗240.907<0.001高级别鳞状上皮内病变112108(96.43)∗#鳞癌9585(89.47)∗

两两比较时经矫正检验水准α’=0.05/[k(k-1)/2]≈0.008，k为比较组数，*：本组与慢性炎症组比较P<0.008，#：本组与低级别鳞状上皮内病变组比较P<0.008。

2.4 PAX1蛋白表达与临床病理特征的关系 在宫颈鳞癌组织中，PAX1蛋白的表达与患者年龄、病理分型、有无淋巴结转移及复发无明显相关(P>0.05，见表4)。

表4PAX1蛋白阳性表达在宫颈鳞癌组织中的表达情况与临床及病理参数的比较(n)

临床病理特征例数阳性阴性χ2 P 年龄≤50 635942.2730.132>50 32266病理分型角化型545132.1740.140非角化型41347淋巴结转移无6858103.0140.083有27270有无复发无88808-0.158∗有752

*：为Fisher确切概率法的结果。

2.5 PAX1甲基化与蛋白检测的关联性 4组患者发生PAX1甲基化总例数为165例，PAX1蛋白阳性表达总例数为208例，两者同时阳性133例，同时阴性80例，进行关联性分析显示两种检测方法之间存在关联性(χ2=36.468，P<0.05)，其关联强度φ=0.338。此外，4组患者总PAX1甲基化率为51.56%(165/320)，PAX1蛋白的总阳性率65.00%(208/320)，两种方法阳性率差异具有统计学意义(χ2=11.882，P<0.05，见表5)。

表5两种检测方法的结果比较 (n)

PAX1甲基化检测PAX1蛋白检测+-合计+13332165-7580155合计208112320

3 讨论

PAX基因家族是一组重要的发育调控基因家族，其在胚胎发育和器官形成中发挥重要作用[8]。在脊椎动物中共有9个成员(Pax1—Pax9)，编码的蛋白质属于螺旋-转角-螺旋蛋白，分布于细胞核，是一类非常重要的转录调控因子，参与细胞内信号传导的调控，在胚胎发育过程中对细胞分化、更新、凋亡等均起重要调控作用[8]。研究表明PAX基因的异常表达会导致多种器官组织发育畸形,某些癌症的发生也与其中的一些成员过量表达有关[5]。PAX1是PAX 基因家族中的一员，由一个配对域(Paired domain， PD) 和一个八肽域(Octapeptide，OP) 结构域构成，主要参与骨骼的发育调控转录，是细胞分化关键基因，也是一种重要的抑癌基因，在胚胎发育过程中发挥重要作用[9]。目前已有文献报道PAX1在多种恶性肿瘤中发挥重要作用，本文主要研究PAX1甲基化与蛋白检测在宫颈鳞癌及上皮内病变的临床病理学意义及关联性。

3.1 PAX1甲基化检测在宫颈鳞癌及上皮内病变中的价值分析 新近研究发现，宫颈癌变过程包括诸多基因及表观遗传与调控基因的改变[10]，其中DNA甲基化为代表的表观遗传学改变已成为目前研究热点，该过程主要表现为肿瘤抑制基因的启动子区域发生异常，导致目的基因及调控基因的转录失活，进而促使肿瘤的发生及发展。此外，DNA甲基化可以通过各种分子检测技术精确地测量，例如，MSP、焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、以及各种基于芯片深度测序的全基因组方法[11]，此次研究采用的是实时荧光定量PCR仪作定性检测，其优点在于：实验设计简单、操作简便、检测时间快、灵敏度高且费用低廉，适用于大量样本的检测[12]。这对于我国一些经济比较落后的地区，实用性相对比较理想。对不同分组癌前病变与宫颈鳞癌分别进行PAX1甲基化检测后，证实PAX1基因在宫颈鳞癌标本中存在异常甲基化，其甲基化率高达89.47%，与宫颈慢性炎症组织及癌前病变存在统计学差异(P<0.05)，随着宫颈病变程度的加重，甲基化率呈上升趋势，这与Xu 等[8]的研究报道一致。通过对宫颈鳞癌组进行临床病理参数对比发现，PAX1甲基化与年龄、病理分型、有无淋巴结转移临床病理特征无明显相关(P>0.05)，但与患者复发相关，推测PAX1的甲基化可能与患者疾病进展相关联，可以判断病变预后情况，对宫颈癌患者治疗的预后评估可能具有指导意义。

3.2 PAX1蛋白检测在宫颈鳞癌及上皮内病变中的价值分析 为了探讨PAX1在宫颈鳞癌发生发展中的作用，采用免疫组织化学染色法检测其从宫颈慢性炎症到恶性肿瘤的整个过程。本实验结果显示：宫颈慢性炎症组织中仅在副基底层见散在阳性颗粒细胞，随宫颈病变程度的加重阳性区域面积逐渐增大，鳞癌组最高，然而，PAX1蛋白表达在鳞癌组表达有所下降，宫颈高级别鳞状上皮内病变组最高，4组比较差异有统计学意义(χ2=244.668，P<0.05)；进行组间两两对比显示，鳞癌组、高级别鳞状上皮内病变组、低级别鳞状上皮内病变组与慢性炎症组差异明显，高级别鳞状上皮内病变组与低级别鳞状上皮内病变组具有统计学差异(P<0.008)。在鳞癌组，PAX1蛋白的表达与患者年龄、病理分型、有无淋巴结转移及复发无明显差异(P>0.05)，这与Liu等[13]研究PAX1蛋白在子宫内膜癌的临床病理特征相似。综上，PAX1蛋白检测有助于高级别与低级别鳞状上皮内病变的鉴别，且其在癌组的表达与临床病理特征无明显相关性。

3.3 PAX1甲基化与蛋白检测的关联性分析 研究发现不同组别存在甲基化患者的蛋白检测结果几乎为阳性表达，仅少部分未甲基化患者的蛋白检测结果仍为阳性表达；4组患者PAX1甲基化率为51.56%，PAX1蛋白表达的总阳性率65.00%，两种方法阳性率具有统计学差异(χ2=11.882，P<0.05)，PAX1蛋白的表达高于其甲基化率。进行关联性分析显示两种检测方法之间存在关联，其关联强度φ=0.338，结合表1、表3结果PAX1甲基化及蛋白表达随病变程度加重总体呈上升趋势，说明PAX1甲基化与PAX1蛋白表达具有正相关性，PAX1甲基化作为表观遗传学修饰形式的改变，PAX1甲基化并没有下调其蛋白的表达，而PAX1蛋白发生其功能与其甲基化之间的相互作用具体机制有待进一步研究。

综上所述，PAX1甲基化率随宫颈病变程度加深逐渐增高，且与宫颈鳞癌复发相关，推测PAX1甲基化可能与患者疾病进展相关联，有助于判断病变预后情况；PAX1蛋白检测有助于宫颈高级别与低级别鳞状上皮内病变鉴别，且在宫颈鳞癌的表达与临床病理特征无明显关联；PAX1甲基化与PAX1蛋白表达随宫颈病变程度的加重总体呈上升趋势，PAX1甲基化与其蛋白表达呈正相关。