乙醇/柠檬酸水溶液提取蓝莓花青素及其抗氧化性研究

李 亮， 刘静芳， 姜海芹， 赵 鑫， 李小倩， 刘让同

(1.中原工学院 纺织学院, 河南 郑州 450007； 2.中原工学院 学报编辑部, 河南 郑州 450007；3.中原工学院 河南省纺织服装产业协同创新中心， 河南 郑州 450007；4.中原工学院 河南省功能纺织材料重点实验室，河南 郑州 450007)

蓝莓是一种天然功能性食品，深受人们喜爱。其富含花青素，具有芳环结构和活泼的羟基，可终止自由基链式反应，清除导致多种疾病的氧自由基，起到抗氧化的作用[1]。目前，提取蓝莓花青素的方法多采用浸渍法、酶辅助提取法和超声辅助提取法[2-5]。关于花青素的提取及其抗氧化性研究已成为热点。王婧等探究了蛋白-花青素复合物在共价/非共价作用机制下的体外消化性能及抗氧化性，发现蛋白-花青素复合物抗氧化性优于蛋白[6]；苏适等采用离子液体超声辅助方法提取了黑豆皮花青素，并分析了其抗氧化活性，发现花青素对羟自由基的清除效果在一定范围内优于维生素C[7]；于长春等对野生黑枸杞的花青素含量进行测定并分析了其抗氧化活性，发现花青素的抗氧化能力随着其浓度的升高而增强[8]。然而，关于花青素提取工艺对其抗氧化性影响的研究较少。因此，本文利用乙醇/柠檬酸水溶液提取蓝莓花青素，分析了乙醇浓度、pH、温度及时间对花青素抗氧化性的影响，以期为蓝莓花青素的开发利用提供理论参考。

1 花青素的提取及抗氧化机理

花青素又称花色素，属于黄酮类化合物，具有C6-C3-C6骨架结构。根据取代基的不同，花青素主要有6种基本配基，其结构式如图1所示。由图1可以看出，花青素具有丰富的-OH，能较好地溶于水中。传统提取花青素的方法多以水溶液为溶剂，然而，花青素易以苷键形式与糖类(阿拉伯糖、葡萄糖或半乳糖)相结合[9]，因此利用水溶液提取花青素时提取率较低，且纯度不高。蓝莓中锦葵色素含量最高[10]，因此可采用乙醇配合柠檬酸水溶液法对其进行提取，提取原理见图2。

由图2可知，锦葵色素与糖类以苷键结合，在乙醇、柠檬酸和水的作用下，苷键被拆解，锦葵色素与糖类物质分散于溶剂体系中。在溶剂体系中，乙醇、柠檬酸构建了酸性环境，使苷键水解，利于锦葵色素与糖类的分离，从而提高蓝莓花青素提取率。

锦葵色素具有丰富的-OH自由基，可以通过抽氢反应和质子伴随的氢转移反应清除DPPH·自由基。然而花青素溶液中的糖类物质不利于其抗氧化性，苷键水解是去除糖类物质的主要方法，而苷键水解程度与提取工艺参数有一定关系，因此，需考察乙醇浓度、pH、温度及时间对花青素抗氧化性的影响。

(a)锦葵色素 (b)飞燕草色素 (c)矢车菊色素

(d)天竺葵色素 (e)芍药色素 (f)牵牛花色素图1 常见花青素的结构式

图2 花青素提取及其抗氧化机理示意图

1 实验

1.1 实验材料

材料：蓝莓(购于水果店)；

试剂：无水乙醇、柠檬酸、冰乙酸、盐酸、乙酸钠、氢氧化钠、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅、恒温磁力搅拌机、高速离心机、电热鼓风干燥器、超声波清洗机、电子天平、循环水式真空泵、紫外可见分光光度计、pH仪器。

1.3 花青素的提取

将蓝莓清洗干净，60 ℃烘干，并研磨成粉，以1∶20的浴比加入由1%柠檬酸与75%乙醇组成的溶液中，以一定温度、pH值处理一定的时间，经抽滤与离心后取滤液，即为蓝莓花青素提取液。

1.4 花青素抗氧化性

花青素的1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基清除能力参照WEN等实验方法[11]。取蓝莓花青素样品50 mL(0.2～2 μmol/mL)，分别溶解于乙醇和DPPH溶液(0.1 μmol/mL，950 μL)中，25 ℃下避光静置30 min。乙醇溶液作为空白调零， DPPH 溶液作为参照。分别测定样品与DPPH在517 nm 波长下的吸光值。计算公式如下：

DPPH 自由基清除活性=(1-Asample/Acontrol)×100%

(1)

式中：Asample为样品吸光值；Acontrol为DPPH吸光值。

2 结果与讨论

2.1 乙醇浓度对蓝莓花青素抗氧化性的影响

乙醇/柠檬酸水溶液中，乙醇浓度的高低对苷键水解反应具有较大影响，进而影响蓝莓花青素的抗氧化性。在温度为55 ℃、pH值为2、时间为100 min时，乙醇浓度对蓝莓花青素抗氧化的影响见图3。

由图3可知，乙醇浓度在55%～70%范围内时，蓝莓花青素抗氧化性随乙醇浓度的增加逐渐增加，然而，在乙醇浓度高于70%时呈下降趋势，故乙醇浓度为70%时其抗氧化性最佳。这主要是因为在乙醇/柠檬酸水溶液中，乙醇浓度的增加会诱导水分子解离产生OH-及H+，OH-进一步诱导乙醇分子解离，并产生CH3CH2O-及H+，进而降低溶液酸性值。这些均有利于蓝莓花青素与糖类物质苷键水解反应，但不利于花青素结构的稳定，因此，在乙醇浓度为70%时蓝莓花青素的抗氧化性最佳。

图3 乙醇浓度对蓝莓花青素抗氧化性的影响

2.2 pH对蓝莓花青素抗氧化性的影响

在乙醇/柠檬酸水溶液中，pH值的高低对溶液中OH-及H+有较大影响，进而影响蓝莓花青素的抗氧化性。在乙醇浓度为70%、温度为55 ℃、时间为100 min时，pH对蓝莓花青素抗氧化的影响见图4。

图4 pH对蓝莓花青素抗氧化性影响

由图4可知，pH值在1～7范围内时，蓝莓花青素抗氧化性随pH值的增加先增加后减小，在pH为2时最佳。这主要是因为在乙醇/柠檬酸水溶液中，pH值越低，越有利于蓝莓花青素与糖类物质苷键的水解反应，但不利于花青素结构的稳定，因此，在pH值为2时花青素的抗氧化性最佳。

2.3 温度对蓝莓花青素抗氧化性的影响

温度高，溶液中分子动能高，分子运动较活跃，利于蓝莓花青素与糖类物质苷键的水解反应。在乙醇浓度为70%、pH值为2、时间为100 min时，温度对蓝莓花青素抗氧化性的影响见图5。

图5 温度对蓝莓花青素抗氧化性的影响

由图5可知，温度在30～70 ℃范围内时，蓝莓花青素抗氧化性随温度的增加先增加后减小，温度为60 ℃时最佳。这说明蓝莓花青素的抗氧化性对温度具有一定的依赖性，温度的增加有利于蓝莓花青素与糖类物质苷键的水解反应，但温度过高会对其抗氧化性产生消极作用。

2.4 时间对蓝莓花青素抗氧化性的影响

时间长短在某种程度上决定了溶液中蓝莓花青素与糖类物质苷键水解反应的程度，时间越长，苷键水解反应越彻底。在乙醇浓度为70%、pH值为2、温度为60 ℃时，时间对蓝莓花青素抗氧化的影响见图6。

图6 时间对蓝莓花青素抗氧化性的影响

由图6可知，蓝莓花青素抗氧化性随时间延长而增强，180 min时达到最佳，DPPH清除率高达81%。这说明延长反应时间有利于蓝莓花青素与糖类物质苷键水解，降低花青素含糖量，进而提高其抗氧化性。

3 结论

蓝莓花青素与糖类以苷键结合，在乙醇、柠檬酸和水组成的酸性环境下，苷键水解，有利于花青素与糖类的分离，从而提高蓝莓花青素的提取效率。蓝莓花青素具有丰富的-OH自由基，可以通过抽氢反应和质子伴随的氢转移反应清除DPPH·自由基。

蓝莓花青素抗氧化性与乙醇浓度、pH、温度及时间有一定关系。在乙醇浓度为70%、pH值为2、温度为60 ℃、时间为180 min时，提取的蓝莓花青素抗氧化性最佳，DPPH清除率高达81%。