热胁迫和培养温度对大肠杆菌抗热性的影响

张爱静，李琳琼，朱 蕾，王鹏杰，高瑀珑*

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

大肠杆菌（Escherichia coli）是一种在自然界和动物肠道内广泛存在，极易造成食品污染的革兰氏阴性菌[1-3]。其在自然界中常常要面临一系列的高温、低温、酸、碱、渗透压等不适环境的胁迫，由于被不适条件胁迫，诱发大肠杆菌启动自我保护机制，多数微生物通过对不断变化的外界环境的适应进行生长繁殖。事实上，在食品生产加工过程中食品原料中的许多微生物经常处在胁迫环境中，面对不适宜其生长繁殖的环境条件，其生理代谢会作出应激反应，这种对不良环境的适应能够使其生存[4-7]。当微生物经历一些不适的胁迫环境，之后再遇到同样类型的不适环境时，其存活能力明显提高，这种作用称为同源性保护作用；而微生物经一些不适环境胁迫，随后在遇到不同类型的不适环境时，其存活能力明显提高，这种作用称之为交叉保护作用[8]。

高温杀菌是目前食品工业中最常使用的一种灭菌加工手段[9]。微生物的耐热性不仅受遗传因素的影响，还受环境因素的影响[10]。微生物会对不利环境因素产生抗性或适应性反应，近年来引起了研究者的广泛关注[11-13]。有研究报道，将乳酸杆菌胁迫于亚致死温度50 ℃条件下30 min，随后置于65 ℃，存活量较无胁迫原菌株增加10～100 倍[14]。Mackey等[15]研究发现，鼠伤寒沙门氏菌和李斯特菌在亚致死温度48 ℃条件下胁迫处理一定时间后，其耐热性比原菌株明显提高。Juneja等[16]将产气荚膜梭菌置于亚致死75 ℃热胁迫后发现，与未经处理的菌株相比，100 ℃条件下杀死某细菌数量90%所需要的时间明显增加，说明经过亚致死热胁迫后的菌体对热致死环境产生了抗热性。研究认为，微生物面对环境温度的突然变化，其生理也会发生变化。如当温度突然上升，金黄色葡萄球菌会迅速作出热激应答，如诱导相关基因的表达，合成热休克蛋白[17-18]。对于大肠杆菌经不同热胁迫和培养温度处理，是否可诱导其对热抗性的变化，即是否产生同源保护作用目前尚不清楚，国内外鲜见相关报道。因此，对大肠杆菌ATCC 43889经不同热胁迫和培养温度诱导后的抗热性进行研究，探明微生物的耐热性是优化食品热加工杀菌条件的关键因素，以期为高温杀菌技术在食品工业中的应用奠定理论基础，对于保障食品加工贮藏安全、建立食品质量安全控制体系具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889，购自于江苏省疾病预防控制中心，采用胰蛋白胨大豆肉汤（trypticase soy broth，TSB）培养[19]。供试菌经活化后，接入TSB液体培养基，36 ℃、140 r/min摇床振荡培养18 h。

TSB、胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar，TSA）培养基、NaCl 南京丁贝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；HZQ-F160全温振荡培养箱 太仓市实验设备厂；GNP-9160隔水式恒温培养箱、SF-CF-2A超净工作台 上海三发科学仪器有限公司；601超级恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；精密电子天平 北京塞多斯天平有限公司；上海三发科学仪器有限公司；A1正置荧光显微镜 德国蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 热胁迫处理大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889

将1.1节活化后的大肠杆菌ATCC 43889以体积分数1%转接至150 mL新鲜的TSB培养基中，36 ℃摇床振荡培养18 h至稳定期，分别取10 mL培养液加入无菌的中号试管（20 mm×200 mm），置于50、60 ℃和70 ℃进行热胁迫处理，各处理15 min，取体积分数为1.5%～2%的各个温度热胁迫后的ATCC 43889菌种分别接种于新鲜的100 mL TSB培养基中，36 ℃振荡培养18 h至稳定期后，再分别取10 mL培养液加入无菌的中号试管，置于50、60 ℃和70 ℃进行热胁迫处理，各处理15 min；以此类推，重复上述摇床振荡培养和热胁迫处理10 次，以备后续80 ℃热处理。ATCC 43889的稳定期是通过平板菌落计数方法结合比浊法测得的生长曲线获得[20]。

1.3.2 大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889抗热性参数D值的测定

微生物耐热参数D值表示在一定的热力致死温度条件下杀死某细菌数量的90%所需要的时间。D值越大，表明细菌的耐热性越强，该菌的死亡速率越慢；D值大小和抗热性的强度呈正比[21]。

1.3.1 节对大肠杆菌ATCC 43889采用50、60 ℃和70 ℃三种热胁迫温度经15 min各处理10 次，每种温度每次热处理时分别测定在3、6、9、12、15 min ATCC 43889存活量（3 个平行），共5 个时间点，以热处理时间为横坐标，存活量为纵坐标，对此5 个时间点进行线性回归分析，所得线性回归方程斜率的负倒数即为D值，分别测得ATCC 43889在50、60 ℃和70 ℃的D值，用线性回归方程的决定系数R2评价此D值拟合度优劣。不同温度下D值的计算如式（1）所示：

式中：N0、Nt分别为热处理前0时刻初始菌体的数量和热处理t时刻之后菌体的数量。

1.3.3 不同温度下培养大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889取1.1节活化的大肠杆菌ATCC 438895按体积分数1%接种至新鲜的TSB中，置于10、28、36 ℃和45 ℃，摇床振荡培养，分别培养120、24、18 h和20 h，达到稳定期，以备后续80 ℃热致死处理。不同培养温度下ATCC 43889的稳定期通过平板菌落计数方法结合比浊法测得的生长曲线获得[20]。

1.3.4 大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889抗热性模型的建立Weibull分布模型最初用于工程金属零件的寿命和材料的疲劳测试，目前已被应用于微生物的非线性致死动力学模型的拟合[22-23]。该模型能较好地模拟外界条件对细菌失活的影响，适用于热力和非热力细菌失活模型的拟合，Weibull模型按照式（2）表示：

式中：N0为0时刻初始菌体数量；Nt为热处理t时刻后存活的菌体数量；t为热处理时间/min；δ和ρ分别为Weibull模型的规模参数和形态参数，其中，δ表示菌体数量第1次减少10 倍所用的时间/min；ρ表示热致死曲线的形状，当ρ=1时，曲线为直线；当ρ＞1时，曲线向下弯曲，为凸形曲线；当ρ＜1时，曲线向上弯曲，为凹形曲线[24-25]。

将1.1节活化的大肠杆菌ATCC 43889与1.3.1节经50、60 ℃和70 ℃反复热胁迫处理10 次传代培养获得的抗热性的4 种ATCC 43889菌株，接种于新鲜的TSB中，36 ℃、140 r/min摇床振荡培养至稳定期。按1.3.3节在10、28、36 ℃和45 ℃条件下140 r/min摇床振荡培养ATCC 43889菌株至稳定期。分别将这8 种培养至稳定期的大肠杆菌ATCC 43889的培养液10 mL加入无菌的中号试管，置于80 ℃进行热处理，每隔2 min取样，以灭菌生理盐水适度稀释，取适量菌悬液在TSA平板上涂布36 ℃培养72 h后，对培养液80 ℃处理前后进行平板菌落计数[20]。80 ℃ATCC 43889的存活量表达式为lg（Nt/N0），N0、Nt分别表示热处理前初始菌体的数量和热处理t时刻之后菌体的数量。以热处理时间为横坐标，ATCC 43889存活量为纵坐标，利用Weibull模型对80 ℃ ATCC 43889致死曲线进行非线性拟合，以此对比评价不同条件下的大肠杆菌ATCC 43889菌株对80 ℃抗热性的强弱。

1.3.5 大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889热胁迫前后菌落形态和个体形态的观察

对未经热胁迫和1.3.1节经过50、60 ℃和70 ℃热胁迫处理10 次后获得的ATCC 43889菌株在TSA平板上培养72 h后，用肉眼直接观察ATCC 43889的菌落形态；用结晶紫与碘液单染色，通过光学显微镜分别观察ATCC 43889个体形态。

1.4 数据统计分析

本研究数据通过JMP（10.0）软件处理，采用Duncan新复极差法进行多重比较，结果以表示，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同热胁迫处理对大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889 D值的影响

表1 大肠杆菌ATCC 43889经不同热胁迫处理后D值的变化Table 1 Changes in D values of E. coli ATCC 43889 after heat stress treatment at different temperatures

从表1可知，所有处理组D值的拟合度均较高（R2＞0.93）；在50、60 ℃和70 ℃热胁迫温度作用下，随着热胁迫处理次数的增加，D值逐渐增大，表明ATCC 43889经过反复热胁迫后，对热的抗性增加。在50 ℃胁迫条件下，ATCC 43889第1次热处理后的D值为3.70 min，到第10次热处理后，D值增加到6.96 min（P＜0.05），是第1次热胁迫处理后的1.88 倍；在60 ℃胁迫条件下，ATCC 43889第1次热处理后D值为3.92 min，到第10次热胁迫后，D值增加到9.33 min（P＜0.05），是第1次热胁迫时D值的2.38 倍；在70 ℃胁迫条件下，ATCC 43889第1次热胁迫后D值为3.35 min，到第10次热胁迫后，D值增加到27.40 min（P＜0.05），是第1次热胁迫处理后的8.18 倍。热胁迫温度越高，D值越大，说明ATCC 43889抗热性越强。ATCC 43889经热70 ℃反复胁迫作用后抗热性增加的最快，显著大于50 ℃和60 ℃胁迫后产生的抗热性（P＜0.05），热胁迫温度为60 ℃时，ATCC 43889的抗热性略高于50 ℃的抗热性。

2.2 不同热胁迫处理对大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889在80 ℃致死的影响

经50、60 ℃和70 ℃热胁迫处理10 次传代培养获得的大肠杆菌ATCC 43889的3 种耐热性菌株与未经热胁迫的对照组，在80 ℃的热致死曲线见图1。利用Weibull模型对ATCC 43889三种耐热性菌株与未经胁迫对照组在80 ℃致死实验数据进行回归拟合，以抗性参数δ评价ATCC 43889的抗热性，通过JMP软件内部自动运行计算得出的抗热性参数δ和ρ见表2。

图1 不同热胁迫处理大肠杆菌ATCC 43889在80 ℃的致死曲线Fig. 1 Death curve at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 undergoing different heat stresses

表2 不同热胁迫大肠杆菌ATCC 43889在80 ℃的热致死模型的拟合度及参数Table 2 Goodness of fit and parameters of thermal death models at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 subjected to different heat stresses

抗性大小与δ呈正比，δ值越大表示其抗热性越强。由图1可知，采用Weibull模型能较好地拟合ATCC 43889在50、60 ℃和70 ℃的热胁迫后获得的抗热菌株在80 ℃作用下的失活曲线，拟合程度较高（R2＞0.953 8）。从表2也可看出，随着胁迫温度的升高，ATCC 43889抗热性呈上升趋势，无热胁迫处理对照组、50、60 ℃和70 ℃，其抗热性参数δ分别为0.64、0.80、1.13 min和1.92 min，其抗热性存在显著性差异（P＜0.05），表明随着胁迫温度的升高，其抗热性显著增加。热胁迫温度70 ℃时，抗热性参数δ是原菌株的3 倍。经过热适应的ATCC 43889比原菌株更加耐热，80 ℃处理16 min后，未经胁迫的对照组ATCC 43889数量下降了7.72 个对数，接近于全部死亡，而经70 ℃热胁迫的ATCC 43889，80 ℃处理16 min后，数量仅下降了3.36 个对数，ATCC 43889存活量明显提高。ρ参数代表热致死曲线的形状，本研究ρ＜1，对于ATCC 43889，Weibull曲线向上弯曲，为凹形曲线，表明模型曲线随着时间的延长下降趋势减缓，ATCC 43889失活率降低。此研究结果表明，提高ATCC 43889的热胁迫温度可诱导其对抗热性的增加。

2.3 不同温度培养大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889在80 ℃的抗热性

经10、28、36 ℃和45 ℃培养后ATCC 43889在80 ℃其热致死曲线见图2。利用Weibull模型对不同的生长温度下培养的ATCC 43889在80 ℃致死实验数据进行回归拟合，用JMP软件进行计算，获得的抗性参数δ和ρ见表3。

图2 不同温度培养大肠杆菌ATCC 43889在80 ℃热处理的致死曲线Fig. 2 Death curves at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 grown at different temperatures

表3 不同温度培养大肠杆菌ATCC 43889在80 ℃热处理抗热性模型的拟合度和参数Table 3 Goodness of fit and parameters of heat resistance models at 80 ℃ of E. coli ATCC 43889 grown at different temperatures

由图2可知，采用Weibull模型也能较好地拟合ATCC 43889经4 种不同温度培养后在80 ℃的失活曲线，拟合程度较高（R2＞0.993 6）。由表3可知，ATCC 43889培养温度为10、28、36 ℃和45 ℃，其在80 ℃的抗热性参数δ分别为2.16、2.24、3.29 min和5.69 min，随着培养温度的升高，其抗热性显著增大（P＜0.05）。与最适生长温度36 ℃相比，生长温度为45 ℃时，ATCC 43889抗热性显著增大（P＜0.05）；而生长温度为10 ℃时，其对80 ℃较为敏感，抗热性显著降低（P＜0.05），生长温度为45 ℃时抗热性参数δ是10 ℃的2.63 倍。由表3可以看出，生长温度为10 ℃和45 ℃时热致死曲线的参数ρ＞1，曲线向下弯曲，为凸形曲线，表明抗性模型曲线随着时间的延长下降趋势变快，ATCC 43889随着时间的延长死亡加快，失活率在增大；而生长温度为28 ℃和36 ℃时热致死曲线的参数ρ＜1，曲线向上弯曲，为凹形曲线，表明抗性模型曲线随着时间的延长下降趋势变慢，ATCC 43889随着时间的延长，失活率在减小。上述研究结果表明，培养温度升高也可胁迫诱导ATCC 43889抗热性的增加。

2.4 热胁迫前后大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889菌落形态和个体形态

图3 大肠杆菌ATCC 43889菌落形态Fig. 3 Colonial morphology of E. coli ATCC 43889

由图3可以看出，未经热胁迫处理的对照组ATCC 43889培养72 h后，在TSA上菌落呈乳白色，边缘整齐，表面有光泽，湿润，光滑，正面和反面色泽一致；经过50 ℃热胁迫后的ATCC 43889，菌落形态与对照组无明显差异；经过60 ℃和70 ℃热胁迫后，菌落发生明显的变化，其表面呈褶皱状、干燥，边缘不整齐，呈锯齿状。

图4 大肠杆菌ATCC 43889个体形态Fig. 4 Cellular morphology of E. coli ATCC 43889

由图4可以看出，未经热胁迫处理的对照组ATCC 43889培养72 h后，在显微镜下个体呈短杆状或球状；经过50 ℃热胁迫后，个体形态略有变化，有极少数个体变长；而经过60 ℃和70 ℃热胁迫后，个体形态发生变化，几乎均变为长杆状，胁迫温度越高，变化越明显。

3 讨 论

细菌的抗热性受菌株种类、细胞状态和环境因素的影响，热胁迫一直是微生物学研究的热点。每种细菌均有其最适生长温度，当温度太高时会引起蛋白质、酶失活，细胞膜破坏，核糖体、DNA、RNA等生物大分子降解[26]。

在食品生产加工过程中，微生物常常要遭受各种不适环境条件的胁迫，诱导出一系列自我保护机制，导致其对致死因素抗性增加。温度是引起细菌细胞组成和生理变化的一个重要因素[27-29]。Heredia等[30]研究发现，产气荚膜梭菌在55 ℃胁迫30 min，细胞的耐热性增加了2～3 倍。本研究发现，大肠杆菌ATCC 43889经热胁迫与升高培养温度，其抗热性均增加，经50、60 ℃和70 ℃反复热胁迫处理后，D值不断增大，且胁迫温度越高，D值越大，抗热性越强；ATCC 43889在不同的培养温度下，超过最适温度能诱导其抗热性升高，而低于最适温度的培养，其抗热性降低。ATCC 43889经过50 ℃热胁迫后，菌落形态与对照组无明显差别；经过60 ℃和70 ℃热胁迫后，其菌落边缘变得不整齐，表面粗糙且干燥，个体形态变长，呈长杆状，热胁迫温度越高，这种变化越明显，这种形态的变化可能有助于其避免高温环境产生热损伤。王丽平等[31]研究发现，某些抗生素作用大肠杆菌后能使其丧失原有的形态，变成细长的杆状，这种形态的变化有助于其抵抗外界不利环境。本研究发现，ATCC 43889经热胁迫后，可使其细胞形态也变成长杆状。高温使ATCC 43889形态变成长杆状与其抗热性的增强可能有一定的关系，对于高温胁迫导致其抗热性升高的作用机制正在研究。本研究发现热胁迫对大肠杆菌ATCC 43889产生的同源性保护作用，热胁迫是否能引起交叉保护作用的相关工作也正在研究。

4 结 论

大肠杆菌ATCC 43889经50、60 ℃和70 ℃反复多次热胁迫处理后，D值显著增加，热胁迫温度越高，D值越大，说明其抗热性越强。经过热胁迫后的ATCC 43889，菌落形态和个体形态发生了变化，热胁迫温度越高，形态变化越明显。经50、60 ℃和70 ℃热胁迫处理10 次传代培养的ATCC 43889在80 ℃的热致死曲线表明，胁迫温度越高，其耐热性越强。在10～45 ℃培养，采用Weibull模型能较好地拟合ATCC 43889在80 ℃作用下的抗热性曲线，随着培养温度的升高，ATCC 43889的抗热性显著增加。综上，一定热胁迫温度和培养温度的升高均有助于保护大肠杆菌ATCC 43889对热处理的失活作用。