浙江玫瑰醋发酵过程中细菌菌群结构变化与有机酸形成相关性分析

方冠宇，穆晓静，蒋予箭*

（浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018）

浙江玫瑰醋是江浙一带的传统调味品，有悠久的生产历史。浙江玫瑰醋在发酵过程中，没有人工添加菌种，米饭经“发花”后“冲缸放水”，由于微生物的优胜劣汰，在微生物达到平衡的同时，不断使原料进行糖化、乙醇发酵、醋酸发酵以及产生各种风味物质。玫瑰醋在发酵过程中，风味物质的生成与发酵过程中微生物群落的代谢活动密切相关。有机酸是玫瑰醋中的重要风味物质，乙酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸等[1-3]不挥发性有机酸能够调和酸味，优质食醋中含有较高的不挥发酸，能够赋予食醋轻柔的口感[4]。

随着生物技术的发展，变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[5-11]和高通量测序[12-13]等技术被应用于发酵食品中。发酵食品中的微生物群落的组成、发酵过程中的变化[14-17]以及功能[18-20]越来越多地被研究。何同杰[21]利用高通量测序技术研究了酸面团中微生物的多样性及其风味物质代谢，发现酸面团中的细菌主要为乳酸杆菌属且其多样性比较丰富，酸面团中有机酸主要由乳酸杆菌属产生，通过添加旧金山乳酸杆菌，酸面团中的有机酸及挥发性风味物质可以显著提高。牟穰[22]对清爽型黄酒酿造微生物群落结构及其与风味物质相关性进行了研究，发现在黄酒发酵过程中醋酸杆菌属、乳酸杆菌属与草酸、酒石酸具有较高的相关性，这与浙江玫瑰醋发酵过程中乳酸杆菌属与草酸、酒石酸具有负相关性不同。许伟[23]采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE技术和克隆文库分析方法研究了镇江香醋醋酸发酵过程中微生物群落结构，除获得几种常见的醋酸菌之外，还得到了较多种类的乳酸菌。王宗敏[24]对镇江香醋醋酸发酵过程中菌群结构变化与风味物质组成之间的相关性进行了研究，发现醋酸杆菌属与乳酸杆菌属在镇江香醋醋酸发酵过程中起着主要作用，并且随着发酵进行醋酸杆菌属相对丰度上升，乳酸杆菌属相对丰度下降，这与浙江玫瑰醋发酵主发酵过程情况一致。

浙江玫瑰醋以籼米为原料，进行浸泡、蒸煮后，在陶缸内搭窝，依靠空气中的霉菌掉落在米饭表面，对淀粉进行糖化，这个过程称为“发花”。糖化结束之后，在陶缸内加水进行乙醇发酵和醋酸发酵称为“冲缸放水”。当发酵液的总酸含量不再上升时，加入发酵液质量3%的NaCl终止发酵。本研究采用高通量测序技术，对“冲缸放水”后的玫瑰醋细菌群落变化进行分析，并用高效液相色谱对发酵过程中玫瑰醋有机酸含量进行测定。采用双向正交偏最小二乘（bidirectiona orthogonal partial least squares，O2PLS）法对细菌群落数据集和有机酸含量数据集之间的相关性进行数据分析和挖掘，找到与有机酸变化高度相关的细菌种类，为找寻玫瑰醋发酵过程中的功能微生物提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中晚籼米为安徽滁州产。

磷酸二氢铵、磷酸均为分析纯；有机酸标准样品：乳酸、丙酸、甲酸、乙酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、L-酒石酸、α-酮戊二酸、草酸（纯度＞99%）；土壤DNA提取试剂盒 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

TGW16台式高速微量离心机 上海中科生物医学高科技开发有限公司；LC-2010AHT高效液相色谱仪日本岛津公司；无菌注射器 新苏医疗器械有限公司；UPWS-1-60D超纯水设备 杭州永洁达净化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 浙江玫瑰醋酿造工艺

籼米100 kg浸泡7 d（每2 d换1 次水）。常压蒸饭30 min，将蒸熟的米饭自然冷却，放入500 kg的陶缸中，将米饭搭成窝状。空气中的微生物进入米饭中，使米饭糖化。当饭窝内出现糖液时，每天将糖液回浇在米饭表面1 次。当饭窝里的糖液高度达到米饭高度的4/5时（米饭放入陶缸后15 d左右），向陶缸内加入300 kg水进行发酵。在此过程中需要定期对发酵液进行搅动，散发发酵产生的热量、通入氧气以及使物料混合均匀。当发酵液的酸度不再升高时（加水后4 个月左右），向发酵液中加入质量分数3%的NaCl终止发酵。再在缸口用塑料膜密封，陈酿1 个月。

1.3.2 取样

玫瑰醋“冲缸放水”后，分别在第0（“冲缸放水”当天）、10、20天……第90天分别取样，取样时先将发酵液混合均匀。

1.3.3 高通量测序

按照土壤DNA提取试剂盒说明书对醋样中微生物DNA进行提取。将提取合格的DNA送上海派森诺生物科技股份有限公司进行个通量测序。测序平台：MiSeq；测序区域：细菌V4区。

1.3.4 有机酸测定

高效液相色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：5%甲醇-95%磷酸二氢铵（6 g/L；pH 2.60）；流速：0.8 mL/min；进样体积：5 μL；柱温：30 ℃；紫外检测器，检测波长：210 nm。

1.4 数据分析

主要利用O2PLS法[25]对玫瑰醋“冲缸放水”后发酵过程中的微生物与风味物质之间的相关性进行分析。该方法是传统偏最小二乘法的延伸，是一种采用潜变量技术进行回归的分析方法[26]。O2PLS的基本原理如图1所示，O2PLS将X和Y变量总共分为3 个部分：i）X和Y彼此相关的变量；ii）X与Y不相关的变量；iii）Y与X不相关的变量。第ii部分和第iii部分变量分别可以再分为两个部分：ii-1）相当于正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）法的成分（orthogonal in X（OPLS），orthogonal in Y（OPLS）），该部分会对O2PLS模型的预测和解释有贡献；ii-2）相当于主成分分析（principal components analysis，PCA）的成分（orthogonal in X（PCA），orthogonal in Y（PCA）），该部分不会影响O2PLS模型的预测功能，但是可以改善模型的解释能力。

图1 O2PLS的基本原理Fig. 1 Schematic demonstration of O2PLS model

通过上面对O2PLS方法的模型分解，可以用下面的公式表达O2PLS：

式中：lX′和lY′分别表示X与Y不相关变量、Y与X不相关变量，l表示得分值；TP’和UQ’表示X与Y相关部分的变量，T和U表示得分值，P’和Q’表示载荷值，得分值与载荷值都通过交叉检验确定；ToPo’和UoQo’表示X与Y不相关部分的变量，To和Uo表示得分值，Po’和Qo’表示载荷值；E和F分别表示X和Y的残差。

用软件Simca-p的分析步骤如下：1）输入数据集，定义变量性质：玫瑰醋发酵时间为观测变量共10 个；细菌相对丰度数据集为自变量（X）共100 个（相对丰度前100 个属）；有机酸数据为因变量Y共有10 个，定义结束后建立模型。2）指定O2PLS模型，进行拟合。3）分析拟合结果，评价模型效果，Simca-p提供了丰富的图示功能，可以绘制各类图形，根据图表结果发现特异点，确定模型的精度要求。4）通过相关性矩阵以及各个统计量寻找分析每个有机酸与细菌之间的相关关系。

2 结果与分析

2.1 玫瑰醋发酵过程中细菌菌群变化

2.1.1 玫瑰醋发酵过程中细菌门水平变化

图2 0 d醋样门水平细菌群落结构Fig. 2 Relative abundances of major bacterial phyla in vinegar sample on day 0

图3 玫瑰醋发酵过程中门水平细菌相对丰度变化Fig. 3 Changes in relative abundances of major bacterial phyla during the fermentation of Zhejiang rosy vinegar

由于第0天为玫瑰醋刚“冲缸放水”后的样品，因此0 d样品中的微生物全部来自于玫瑰醋“发花”过程，其门水平的细菌菌群结构见图2。第0天的样品中总共检测出5 个门。分别为变形菌门（Proteobacteria，40.65%）、厚壁菌门（Firmicutes，55.09%）、放线菌门（Actinobacteria，4.04%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，0.21%）、梭杆菌门（Fusobacteria，0.011%）。这些细菌与栾同青[27]研究的黄酒中细菌种类一致，也与浙江玫瑰醋在“冲缸放水”后主要先进行乙醇发酵的实际情况相符。

玫瑰醋发酵过程中，总共检测到25 个门。对浙江玫瑰醋发酵不同时间发酵液中的细菌群落结构进行分析，如图3所示，变形菌门和厚壁菌门在整个玫瑰醋发酵过程中占绝对优势，其相对丰度之和大于95%。在发酵过程中，除早期发酵（0～10 d）变形菌门相对丰度略微降低，厚壁菌门的丰度略微增加外。其他发酵阶段，变形菌门相对丰度持续升高，而厚壁菌门相对丰度持续降低。这是由于玫瑰醋的前期发酵为乙醇发酵，到发酵第7天左右，发酵液中的乙醇体积分数达到最高，后面的发酵以醋酸发酵为主导。直到80～90 d，厚壁菌门的相对丰都接近0，变形菌门的相对丰度达到最高，两者趋于稳定。说明玫瑰醋在发酵过程中变形菌门起主导作用。在整个发酵过程中放线菌门和拟杆菌门一直存在，但是相对丰度很低。

2.1.2 玫瑰醋发酵过程中细菌属水平变化

由于在提取基因组时，人体、空气等外界环境也会因人员操作而带入微生物，在扩增及测序环节使外界环境微生物与样品微生物一起被测出。为排除人为操作以及测序时机器读取误差，保证测定结果的准确性，本研究仅对相对丰度不小于1%的细菌属进行分析。

图4 玫瑰醋酿造过程中主要细菌属相对丰度变化Fig. 4 Changes in relative abundances of major bacterial genera during the fermentation of rosy vinegar

浙江玫瑰醋是对传统工艺特色保留比较完整的一种调味品，其纯粹依靠空气中多种微生物在煮熟的米饭中生长、繁殖，通过菌群的优胜劣汰，在达到微生物平衡的同时，使淀粉物质不断液化、糖化、酒化、醋化等过程。由图4可以看出，玫瑰醋在“冲缸放水”后，醋醪中的细菌的演替过程。除去第0天的样品，醋醪中的醋酸杆菌属（Acetobacter）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）的丰度达到80%以上。说明玫瑰醋在发酵过程中醋酸杆菌属和乳酸杆菌属起主导作用。在“冲缸放水”后的1 周时间里，玫瑰醋主要进行乙醇发酵，在第7天左右，醋醪的乙醇体积分数达到最高值，而后主要进行醋酸发酵，因此在10 d以后醋酸杆菌的相对丰度呈现持续上升的趋势，在第60天其丰度达到最高，60 d后醋酸杆菌属的相对丰度出现波动，说明醋酸杆菌属的丰度达到平衡。在发酵过程中乳酸杆菌属的相对丰度呈现持续下降的趋势，这是由于玫瑰醋在发酵过程中，不断对发酵液中的糖分进行消耗，发酵液的pH值也不断降低，对醋酸杆菌属产生了抑制作用。玫瑰醋的发酵过程无人工添加菌种，由于米饭表面很适宜霉菌生长，因此“发花”过程中，大量霉菌在米饭表面生长繁殖使米饭充分糖化。“冲缸放水”后，随着糖分浓度的降低，细菌会迅速繁殖，但由于适宜的糖浓度乙醇发酵很迅速，在发酵第7天时，乙醇体积分数达到了最高值7%左右（图5）。因此随着乙醇体积分数的升高不耐乙醇的细菌消失，醋酸杆菌属等细菌迅速繁殖进行醋酸发酵。玫瑰醋为静态表面发酵，其主要的发酵过程集中在发酵液表面，由于发酵产热，发酵液表面的温度最高可达40 ℃左右，这种高温使不耐热的细菌不易生长。玫瑰醋发酵只有液面接触氧气，液面以下的发酵液隔绝氧气，适合一些厌氧或兼性厌氧菌的生长，因此醋醪中乳酸杆菌属的相对丰度较高。随着发酵的进行，发酵液中的营养成分消耗以及pH值持续下降，许多不耐酸细菌就会消失。经过醋醪环境的多重选择，醋醪中的微生物趋于稳定，这种现象可以看做微生物的“自我净化”。

图5 浙江玫瑰醋发酵过程中乙醇体积分数变化Fig. 5 Change in alcohol content during the fermentation of Zhejiang rosy vinegar

经过细菌对环境的适应与平衡，醋醪中的微生物趋于稳定。除相对丰度较高的醋酸杆菌属和乳酸杆菌属外，还有一些相对丰度较低的细菌能够适应醋醪环境一直存在与整个发酵过程中，如肠球菌属（Enterococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、盐单胞菌属（Halomonas）、链球菌属（Streptococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）。这与固态发酵醋的细菌种类有所差异，固态发酵醋发酵过程中，细菌除醋酸杆菌属和乳酸杆菌属外，其他细菌为乳球菌属、葡糖醋酸杆菌属、肠球菌属、黄单胞杆菌属和芽孢杆菌属[24]。除醋酸杆菌和乳酸杆菌属外，肠球菌属和芽孢杆菌属在两种醋的发酵过程中都存在。其中，芽孢杆菌属虽然丰度很低，但它们对风味物质的形成起着重要的作用[28]。有研究表明[29]，假单胞菌可以川芎嗪以及其合成前体2,3-丁二酮、3-羟基丁酮。假单胞菌属和不动杆菌属在黄酒发酵过程中有检出[22]，这两种菌在玫瑰醋中检出可能是由于玫瑰醋前期发酵主要为乙醇发酵，类似于黄酒发酵过程。

2.2 玫瑰醋发酵过程中有机酸组成

2.2.1 玫瑰醋发酵过程中有机酸含量变化

图6 玫瑰醋发酵过程中有机酸含量变化Fig. 6 Changes in organic acid contents in rosy vinegar during fermentation

用高效液相色谱法对发酵过程中玫瑰醋样品的9 种有机酸含量进行测定，结果见图6。在整个玫瑰醋的发酵过程中，有机酸含量呈现持续上升的趋势，在80～90 d，有机酸含量略微下降，说明玫瑰醋发酵基本结束。在第0天时，有机酸质量浓度高达37.60 g/L，乳酸质量浓度高达22.44 g/L，说明在玫瑰醋的“发花”阶段积累了大量有机酸。乳酸含量除在前期发酵（0～10 d）略微上升外，在发酵过程中一直呈现下降趋势。乳酸主要在3 个过程中产生：1）大米在浸泡过程；2）“发花”过程；3）早期发酵过程。大米在浸泡的过程中由于乳酸菌等微生物的作用，产生大量乳酸。“发花”过程中自然培养生成的红曲霉、根霉和毛霉等是玫瑰醋中生成乳酸的主要原料来源，其余是由乙醇发酵环节的密闭发酵期或醋酸发酵环节后期的米醋发酵醪中乳酸杆菌和链球菌作用而生成，除此之外，有些种类的乳酸菌能将丙酮酸作为受氢体而生成乳酸[30]。乙酸含量随着发酵的进行，一直呈现上升的趋势。乙酸和乳酸含量占有机酸总量的比例最高，在整个发酵过程中，乙酸和乳酸含量达到有机酸总量的90%左右，说明乙酸和乳酸为玫瑰醋的主要有机酸。苹果酸、α-酮戊二酸和草酸基本上都是在“发花”过程产生，在发酵过程中含量变化不大。酒石酸、焦谷氨酸和丙酮酸在发酵过程中呈现缓慢上升趋势。除乙酸、乳酸外的7 种有机酸（丙酮酸、草酸、α-酮戊二酸、焦谷氨酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸）含量在总有机酸含量中占比很低，但大部分还是由“发花”过程产生。这些有机酸大部分是三羧酸循环途径的中间代谢物，在生成的同时也被作为其他代谢途径的前体进入更为复杂的代谢途径，所以其在醋酸发酵过程中不会有大量的积累。

2.2.2 玫瑰醋发酵过程中有机酸含量PCA和聚类分析

图7 玫瑰醋发酵过程中有机酸含量PCAFig. 7 PCA of organic acid contents during rosy vinegar fermentation

根据PCA得分值和载荷值，可以得到每个发酵阶段对应的物质种类。由图7可以看出，有机酸含量基本呈现向第1主成分正向变化。在发酵初期，玫瑰醋中主要的呈味有机酸为乳酸。发酵后期呈味有机酸比较丰富，主要的呈味有机酸有乙酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、焦谷氨酸、酒石酸。这与玫瑰醋有机酸变化含量变化规律相符，在发酵后期，有机酸含量基本达到最高，呈味有机酸比较更丰富。由图8可以看出，玫瑰醋发酵过程中有机酸含量的聚类分析结果与PCA结果相似。聚类分析主要将玫瑰醋发酵过程中有机酸含量分为发酵前期、发酵中期和发酵后期3大类。在发酵中期，20 d和30 d的玫瑰醋样品有机酸含量可以聚为一个小类，50 d和60 d的玫瑰醋样品有机酸含量可以聚为一个小类。这与玫瑰醋发酵过程中有机酸含量的PCA结果相符。

图8 玫瑰醋发酵过程中有机酸含量聚类分析Fig. 8 HCA analysis of organic acid contents in rosy vinegar during fermentation

2.3 玫瑰醋发酵过程与有机酸相关细菌分析

2.3.1 与有机酸相关的细菌重要性指标（variable importance for the projection，VIP）分析

图9 与有机酸相关的VIP分析Fig. 9 VIP plot of the important bacteria correlated with organic acids

利用O2PLS模型对细菌相对丰度与有机酸含量进行相关性分析，可以得出X变量（细菌的相对丰度）与Y变量（有机酸含量）相关性的自变量重要性指标（VIP（pred））。由图9可以看出，细菌的VIP（pred）在0.15～1.50之间。VIP（pred）大于1.4的有6 个属，VIP（pred）值在1.3～1.4之间有5 个属，VIP（pred）值在1.2～1.3之间有4 个属，VIP（pred）值在1.1～1.2之间有3 个属，VIP（pred）值在1.0～1.1之间有5 个属。其中醋杆菌属、乳杆菌属与有机酸相关重要性最高。选取VIP（pred）大于1的23 个细菌属进行与有机酸相关性分析。

2.3.2 玫瑰醋发酵过程中与有机酸相关的细菌分析

选取VIP（pred）大于1的细菌（属）与有机酸进行相关性分析，将有机酸与细菌的相关性系数做成Heatmap图。由图10可知，与乙酸呈现正相关的细菌有7 个属，负相关16 个属，与乙酸呈现最高正相关性的细菌有醋酸杆菌属；与乳酸呈现正相关的细菌有16 个属，负相关细菌7 个属，与乳酸呈现最高正相关性的细菌为乳酸杆菌属；与苹果酸呈现正相关的细菌有13 个属，负相关细菌10 个属，与苹果酸呈现最高正相关的细菌为梭杆菌属；与琥珀酸呈现正相关性的细菌有9 个属，呈现负相关细菌14 个属，与琥珀酸呈现最高正相关的细菌为醋酸杆菌属；与酒石酸呈现正相关性的细菌有7 个属，呈现负相关性细菌16 个属，与酒石酸呈现最高正相关细菌为醋酸杆菌属；与α-酮戊二酸呈现正相关的细菌有12 个属，呈现负相关性细菌11 个属，与α-酮戊二酸呈现最高正相关性细菌为[Eubacterium]_rectale_group；与草酸呈现正相关细菌有9 个属，呈现负相关性细菌有14 个属，与草酸呈现最高正相关性细菌为醋酸杆菌属；与丙酮酸呈现正相关的细菌有6 个属，呈现负相关细菌有17 个属，呈现最高正相关的细菌为醋酸杆菌属；与焦谷氨酸呈现正相关的细菌有6 个属，呈现负相关的细菌有17 个属，与焦谷氨酸呈现最高正相关细菌为醋酸杆菌属。

图10 细菌与有机酸相关性系数HeatmapFig. 10 Heatmap for correlation coefficients between bacteria and organic acids

表1 与有机酸相关性系数|ρ|大于0.6的细菌Table 1 Bacteria showing correlation coef ficients with organic acids greater than 0.6

表1为与有机酸的相关性系数|ρ|大于0.6的细菌属，这些细菌与有机酸具有较好的相关性。可以看出，醋酸杆菌属除与苹果酸和α-酮戊二酸的相关性（|ρ|）小于0.6外，与其他有机酸的相关性均大于0.6。醋酸杆菌属与乙酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、丙酮酸、焦谷氨酸均具有较好的正相关性，与乳酸具有较高的负相关性，说明醋酸杆菌属在玫瑰醋发酵过程中对有机酸的产生具有重要作用。在浙江玫瑰醋发酵过程中，醋酸菌中的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶能够将乙醇氧化成乙酸，因此醋酸菌与乙酸具有很高的相关性。有研究表明醋酸菌可以利用碳源产生酒石酸、琥珀酸等有机酸，因此醋酸杆菌属与这些有机酸也具有较高的相关性。由于发酵初期，发酵液中积累了大量“发花”过程产生的糖类物质，而玫瑰醋发酵过程中只有液面表面与空气接触，乳酸菌可以利用糖类进行厌氧发酵产生大量乳酸，在发酵初期积累了大量乳酸，因此乳酸杆菌属、乳球菌属等细菌与乳酸高度正相关。但随着发酵进行，由于乙醇发酵以及pH值下降等原因，会抑制乳酸菌的生长，而醋酸菌会迅速繁殖，乳酸可以作为碳源被醋酸菌利用，因此醋酸菌与乳酸负相关。除乙酸和乳酸外的其他有机酸（苹果酸、琥珀酸、酒石酸、α-酮戊二酸、草酸、丙酮酸和焦谷氨酸）大部分为微生物的丙酮酸或三羧酸循环的产物，在生成的同时也被作为其他代谢途径的前体进入更为复杂的代谢途径，所以其在醋酸发酵过程中不会有大量的积累。因此从图3～8可以看出，这些有机酸与细菌的相关性低于乙酸和乳酸与细菌的相关性。

3 结 论

通过对浙江玫瑰醋发酵过程中细菌菌群相对丰度以及有机酸含量的测定，并用O2PLS对细菌与有机酸进行相关性分析，得出了浙江玫瑰醋在“冲缸放水”后的发酵过程中与有机酸相关性较强的功能细菌。利用O2PLS模型对细菌相对丰度与有机酸含量进行相关性分析，可以得出X变量（细菌相对丰度）与Y变量（有机酸含量）相关性的自变量重要性指标（VIP（pred））大于1的细菌有醋酸杆菌属、乳杆菌属、甲基杆菌属等；选取VIP（pred）大于1的细菌与有机酸进行相关性分析，得到了细菌与有机酸的相关性Heatmap，并得出了与各种有机酸相关性系数|ρ|大于0.6的细菌属，以及与有机酸具有较强正、负相关性的细菌属。例如醋酸杆菌属、瘤胃球菌属、海洋杆菌属与乙酸具有较好的正相关性；乳杆菌属、乳球菌属、另枝菌属、不动杆菌属、水小杆菌属等细菌与乳酸具有较好的正相关性。结果为找寻玫瑰醋发酵过程中的功能微生物，提升玫瑰醋品质提供数据支持。