东北传统发酵食品中降胆固醇乳酸菌的筛选及其降解机制

任大勇，曲天铭，杨 柳，安 彬，王国超，冯时蓉

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

世界卫生组织预测，2030年心血管疾病仍然是人类的主要死亡原因之一[1]。流行病学研究表明，血清中高于正常水平的胆固醇含量与心血管疾病的发生有着密切的关系[2]。高胆固醇血症是冠心病以及动脉粥样硬化等心血管疾病的主要影响因素。临床研究表明，正常人体中血清胆固醇水平每升高1 mmol，患冠心病的风险将增加35%，而如果其含量每降低1%，患病的概率将会减少2%～3%[3]。目前，对高胆固醇血症的患者主要使用药物进行治疗，如他汀类药物等，但是药物治疗仍存在高成本以及副作用等风险[4]。因此，研发安全、高效降胆固醇的功能性食品成为目前研究热点，这对于预防和辅助治疗高胆固醇血症具有重要的现实意义。

近年来，有研究表明乳酸菌具有较好的降胆固醇作用[5-6]，涉及到多种复杂的降解机制。一般认为，乳酸菌能够产生胆汁盐水解酶（bile salt hydrolase，BSH），该酶能够将胆汁盐（胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸的结合物）在人体肝肠循环中解偶联[7]成游离的胆酸和氨基酸残基[8-9]，而游离的胆酸会与胆固醇产生共沉淀从而去除胆固醇。其次，一些热杀死的益生菌也能够通过膜吸附的方式从培养基中去除一定量的胆固醇[10-12]。另外，部分益生菌还可以通过抑制肠胆固醇胶束的形成，破碎的胶束不能将脂肪酸运输到肠黏膜表面进行吸收，从而导致胆固醇含量降低[13]。

东北传统发酵食品黏面子、辣酱、辣白菜等作为我国东北地区常见的食物同时也是乳酸菌的良好来源[14-15]，近年来对于这些食品菌种资源与功能的研究甚少。本实验旨在分离出具有高效降解胆固醇能力的乳酸菌，并综合分析其存在的主要降解机制，为特定功能益生菌的开发与利用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黏面子、辣酱、辣白菜为黑龙江地区农家自制发酵食品，并保存于吉林农业大学食品科学与工程学院食品毒理与安全实验室。

MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基 青岛海博生物技术有限公司；巯基乙酸钠、牛胆盐、胆固醇 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；氢氧化钾、正己烷、冰醋酸、浓硫酸、茚三酮试剂（0.5 mL体积分数1%茚三酮在0.5 mol/L pH 5.5柠檬酸盐缓冲液中，1.2 mL体积分数30%甘油，0.2 mL 0.5 mol/L pH 5.5柠檬酸盐缓冲液）北京化工厂；甘胺胆酸钠、牛磺胆酸钠 上海源叶生物技术有限公司；蛋黄卵磷脂、胰蛋白酶、胃蛋白酶北京索莱宝科技有限公司；RNAiso Plus 宝生物工程（大连）有限公司；FastKing RT Kit（With gDNase）、SYBR Green I荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）试剂盒、Taq Mix天根生化科技（北京）有限公司；实验所用引物由库美公司（中国长春）合成。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD型净化工作台 上海新苗医疗器械制造有限公司；WMW-02型电热恒温培养箱 湖北省黄石市医疗器械厂；Red-96G型梯度PCR仪 上海山富科学仪器有限公司；OHG-914358-III型岛津紫外-可见分光光度计 岛津国际贸易（上海）有限公司；DYCZ-24DN电泳仪 北京六一仪器厂；JYP2-II超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司；Stratagene Mx300p qPCR仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种制备

实验前，将菌株活化2 次，然后按1∶50（V/V）接种到含100 µg/mL胆固醇的MRS培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，用于后续实验。

1.3.2 降胆固醇乳酸菌的体外筛选

取0.5 mL上述培养液，加入3 mL体积分数95%乙醇溶液和2 mL 0.5 mg/mL氢氧化钾溶液，振荡混匀。于60 ℃恒温水浴10 min，冷却后加入5 mL正己烷，旋涡振荡1 min，加入2 mL蒸馏水，振荡均匀，静置分层。取上层正己烷，60 ℃氮气吹干，加入4 mL 0.5 mg/mL邻苯二甲醛溶液（用冰醋酸定容）和2 mL浓硫酸，显色反应20 min,于553 nm波长处测定吸光度[16-17]。所有实验重复5 次。

1.3.3 乳酸菌解离胆汁盐与胆固醇的共沉淀

新鲜制备的无菌MRS肉汤中补充6 mmol/L甘氨胆酸钠、6 mmol/L牛磺胆酸钠或二者的混合物（2.8 mmol/L甘氨胆酸钠和1.2 mmol/L牛磺胆酸钠）。胆固醇溶液过滤除菌，并添加到培养基中使其质量浓度为100 μg/mL。以每种菌株1%的水平接种，并在37 ℃厌氧培养24 h。之后，将细胞离心（10 000×g、4 ℃、10 min）。胆固醇含量测定同1.3.2节。共沉淀结果通过培养后与对照组（无胆汁的MRS肉汤）中胆固醇的质量浓度差异确定[18]。所有实验重复3 次。

1.3.4 乳酸菌BSH的定性测定

将乳酸菌在含有5 mg/L牛磺脱氧胆酸钠盐或甘氨胆酸钠和0.37 g/L氯化钙的MRS琼脂平板上生长。平板在厌氧条件下37 ℃培养72 h[18-19]。以菌落产生的不透明晕圈或不透明颗粒状白色菌落特征表示胆盐水解酶活性。

1.3.5 乳酸菌BSH的定量测定

通过测定由乳酸菌菌株从胆汁盐释放的氨基酸的量测量BSH活性[20]。菌株在MRS肉汤中培养24 h，在4 ℃、10 000×g离心10 min。将细胞沉淀物洗涤2 次，然后悬浮于10 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中。在600 nm波长处将细胞浓度调节至1 个单位的OD值。将5 mL细胞悬液冰浴超声处理3 min，然后在4 ℃、10 000×g离心10 min。向获得的0.1 mL适当稀释的上清液中加入1.8 mL 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 6.0）和0.1 mL结合的胆汁盐。使用的共轭胆汁是6 mmol/L甘氨胆酸钠、6 mmol/L牛磺胆酸钠或6 mmol/L结合胆汁盐混合物（甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠）。混合物在37 ℃温育2 h。向0.5 mL样品中加入0.5 mL质量浓度为0.15 mg/mL的三氯乙酸溶液终止酶促反应。将混合物离心分离，将0.2 mL上清液加入到1 mL蒸馏水中，加入1 mL茚三酮试剂（0.5 mL体积分数为1%茚三酮在0.5 mol/L pH 5.5柠檬酸盐缓冲液中，1.2 mL体积分数为30%甘油，0.2 mL 0.5 mol/L pH 5.5柠檬酸盐缓冲液）。将制备物涡旋并煮沸45 min。冷却后，使用甘氨酸或牛磺酸作为标准测定570 nm波长处的吸光度。一个单位的BSH活性定义为每分钟从底物释放1 μmol氨基酸的酶量。并通过蛋白定量试剂盒测定蛋白质质量浓度。所有实验重复3 次。

1.3.6 BSH基因的PCR检测

BSH具有4 个基因编码序列[21]，并分别将其命名为bsh1～bsh4。通过参照NCBI数据库比对，设计了4 对引物进行BSH的基因扩增（表1）。PCR体系为：上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、dNTP Mix 2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、ddH2O 18.2 μL。PCR条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s（bsh2基因退火温度为53 ℃），72 ℃延伸60 s，35 个循环。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers used in this study

1.3.7 RT-qPCR检测4 种bsh基因的表达情况

表2 RT-qPCR引物Table 2 Primer sequences used for RT-qPCR

表3 RT-qPCR体系Table 3 Composition of fluorescent quantitative RT-qPCR system

以植物乳杆菌16S rRNA为内参基因[22-23]，根据NCBI数据库提供的基因序列分别设计bsh1、bsh2、bsh3、bsh4以及内参基因的引物（表2）。利用Trizol法提取乳酸菌的总RNA。将培养24 h的菌株离心（8 000×g、4 min、4 ℃），去除上清液并用无RNA酶磷酸盐缓冲溶液洗涤2 次。取沉淀加入250 μL溶菌酶，37 ℃水浴30 min。加入1 mL Trizol裂解液，体积比1∶5的氯仿，12 000×g、4 ℃离心15 min。取上清加入等体积异丙醇混匀静止后于12 000×g、4 ℃离心10 min获得RNA沉淀，用体积分数75%乙醇漂洗，晾干。利用FastQuant RT Kit（with gDNase）试剂盒反转录合成第1链cDNA。利用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒进行实时荧光定量PCR分析，反应体系见表3。反应程序：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循环40 次。荧光定量的结果采用内参基因的ΔCt方法对目的基因的表达量进行分析（n＝3）。目的基因的相对表达量公式为2-ΔCt。

1.3.8 细胞超声处理对去除胆固醇的影响

通过测定不同培养基条件下菌株对超声波的耐受性确定胆固醇在细胞膜上的吸附情况。将活化菌株按1∶50（V/V）分别接种至MRS液体培养基、仅含100 µg/mL胆固醇胶束溶液的MRS培养基以及含质量分数0.2%胆盐和100 µg/mL胆固醇的MRS液体培养基中。培养24 h后，取1 mL菌悬液于冰浴下，130 W、20 kHz、40%超声破碎10 个循环（15 s/次），采用平板计数法对超声处理和未经超声处理的乳酸菌进行计数，计算3 种培养基下菌体经超声波破碎后的存活率。

1.3.9 细胞热处理对去除胆固醇的影响

将菌株的过夜培养物接种到10 mL的MRS肉汤中，并在37 ℃孵育24 h，1 800×g离心15 min，收集细胞，用蒸馏水洗涤2 次，再悬浮于10 mL蒸馏水中于121 ℃高压灭菌15 min以制备热灭活细胞，以未经热处理的细胞作为对照。将加热灭活的细胞悬浮于含有牛磺胆酸钠的胆固醇MRS肉汤中（pH 6.8）。静息细胞处理是将它们悬浮于含有0.05 mmol/L牛磺胆酸钠和胆固醇的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）。在相同的温育和离心条件下测定MRS肉汤中胆固醇含量。

1.3.10 抑制胆固醇胶束的形成

将活化后的菌株在4 ℃、12 000×g离心15 min，将细胞沉淀用磷酸盐缓冲液（pH 6.5）洗涤2 次，最后再悬浮于缓冲液中，并用缓冲液调节菌株OD600nm值为1。然后将悬浮液离心（3 500×g，15 min），将沉淀重悬于2 mL含有3 mmol/L胆固醇、30 mmol/L牛胆盐和20 mmol/L卵磷脂的溶液中。补充胰蛋白酶0.1 mg/L并调节pH值至8.0。对照不含乳酸菌。将混合物置于冰浴中超声处理15 min。将超声处理的混合物在37 ℃孵育24 h。将混合物以12 000×g离心15 min。收集上清液，在450 nm波长处以磷酸盐缓冲液作为空白对照测量溶液的透光率[13]。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 降胆固醇菌株的体外筛选

前期从发酵食品中分离出120 株乳酸菌，经过16s rRNA鉴定，这些菌株主要分为乳杆菌、明串珠菌和链球菌。其中植物乳杆菌82 株，肠膜明串珠菌亚种8 株，清酒乳杆菌5 株，副干酪乳杆菌7 株，还有乳酸链球菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌等。图1显示了胆固醇的清除率大于40%的菌株（共57 株，均为植物乳杆菌），其中6 株菌（C1、C2、H6、H9、L22、L30）的清除率高于85%。因此选取这6 株菌进行下一步降解机制的研究，并选取实验中降解能力最低的菌株T19（清除率为20.7%）作为阴性对照菌株。

图1 部分菌株对培养基中胆固醇的清除作用（n＝5）Fig. 1 Assimilation of cholesterol in culture medium by selected strains (n = 5)

2.2 胆固醇与解离胆汁盐共沉淀

表4 胆固醇与解离的甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠共沉淀（n＝3）Table 4 Cholesterol co-precipitation with bile acid derived from sodium glycocholate and sodium taurocholate by Lactobacillus plantarum(n= 3)

表4显示了在不同的植物乳杆菌环境中，胆固醇与甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的解离产生胆酸的共沉淀作用。所有菌株均显示出了对这两种胆酸盐及其混合物不同程度的胆固醇共沉淀作用。菌株C2可使胆固醇与甘氨胆酸钠解离的胆酸产生最高的共沉淀（5.53±0.20）μg/mL，同时C2也在混合胆汁盐存在的条件下具有最高的胆固醇沉淀能力。但几乎所有菌株沉淀（除了H9）牛磺胆酸的能力都较低。对照菌株T19沉淀胆酸的能力显著低于其他菌株（P＜0.05）。

2.3 BSH活性测定结果

图2 BSH活性检测Fig. 2 Assay of BSH activity

如图2所示，在加入胆汁盐的培养基中明显观察到了滤纸片周围产生了白色不透明的沉淀，表明7 株植物乳杆菌均具有BSH活性。根据产生沉淀圈的大小可粗略的估测出菌株H6具有较高的BSH活性，而阴性对照菌株T19表现出了最小的沉淀圈，说明菌株T19的BSH活性最低。

7 株植物乳杆菌细胞提取物的BSH活性见表5。所有菌株在牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠以及混合胆汁盐存在的条件下均显示出了不同程度的BSH活性（0.31～1.73 U/mg）。与牛磺胆酸钠相比，所有的菌株（除了H9）均显示出了对甘氨胆酸钠更高的底物特异性。在甘氨胆酸钠以及混合胆汁盐为底物的条件下，菌株H6均具有最高的BSH活性，这与平板法粗测BSH活性实验结果相符。阴性对照菌株T19的BSH活性显著低于其他6 株菌（P＜0.05），与2.2节共沉淀效应结果一致，因此推断菌株间BSH活性的差异可能是造成其胆固醇降解率差异的主要原因之一。

表5 菌株在以甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠为底物时的BSH活性（n＝ 3）Table 5 BSH activity of strains with sodium glycocholate and sodium taurocholate as substrates (n= 3)

2.4 4 种bsh基因PCR检测结果

使用bsh基因引物通过PCR方法从7 株植物乳杆菌DNA中扩增了4 种基因，命名为bsh1、bsh2、bsh3、bsh4。基因测序及同源性分析表明，4 种基因均属于植物乳杆菌BSH基因。其中bsh1基因长度为1 048 bp，bsh2基因长度为1 000 bp，bsh3基因长度为956 bp，bsh4基因长度为918 bp。说明包括对照菌株T19在内的7 株植物乳杆菌均存在BSH基因。

图3 4 种BSH基因的PCR电泳结果Fig. 3 Electrophoresis of PCR amplified products of four bile salt hydrolase genes

2.5 BSH基因的相对表达量

qPCR结果显示，所有菌株的bsh1基因相对表达量最高（P＜0.05），其次是bsh3和bsh2，而bsh4最低（图4）。因此，受试菌株的BSH活性可能受bsh1基因表达的影响更大。菌株H6、L22、C2的bsh1表达量高于C1、H9、L30。菌株H6具有最高的表达量4.25×10-3，对照菌株T19表达量最低（1.53×10-3）（P＜0.05），这可能是导致T19菌株BSH活性低的主要原因。

图4 6 株菌株中4 种BSH基因的相对表达水平（n＝3）Fig. 4 Relative expression levels of four bile salt hydrolase genes in six strains (n = 3)

2.6 超声处理对胆固醇环境中乳酸菌存活率的影响

超声处理对乳酸菌存活率的影响与其生长环境中是否存在胆固醇密切相关（表6）。在不含胆固醇的MRS培养基中，7 个菌株的存活率为0.68%～1.52%。在含有胆固醇的MRS培养基中，存活率上升到1.45%～2.65%。在同时含有胆固醇和胆盐的MRS培养基中，存活率进一步提高至5.6%～21.18%。原因可能是由于胆固醇吸附在乳酸菌细胞膜表面，从而增加了细胞膜的韧性。胆汁盐作为表面活性剂增加了细胞膜的通透性，使更多的胆固醇吸附在细胞膜表面。因此菌体在超声处理后的存活率显著提高。对照组菌株T19在加入胆盐后的存活率提高不显著，可能是由于其本身对胆盐的耐受性较低。

表6 超声处理对不同培养基中乳酸菌存活率的影响（n＝5）Table 6 Survival rates of cells in various media before and after sonication (n= 5)

2.7 热处理对乳酸菌去除胆固醇能力的影响

图5 处于生长、热处理、静息状态下6 株植物乳杆菌的胆固醇清除能力（n＝5）Fig. 5 Cholesterol-scavenging abilities of 6 strains of L. plantarum under growth, heat treatment and resting state (n = 5)

如图5所示，静息状态下的6 株乳酸菌对胆固醇的清除率为18%～45%，热处理后的菌体仍然具有10%～22%清除率。这说明即使在乳酸菌菌体细胞被破坏的情况下，仍然可以通过破碎的细胞膜吸附环境中的胆固醇。阴性对照组菌株T19与受试的其他6 个菌株情况类似，说明虽然细胞膜起到一定的吸附作用，但这并不是影响这些菌株降解效率的主要因素。

2.8 乳酸菌抑制胆固醇胶束的形成

胆固醇胶束的破坏会导致形成胶束的物质析出，从而使溶液的透光降低[24-25]。乳酸菌在模拟肠道环境条件下抑制胆固醇胶束形成的结果见图6。与空白对照组相比，加入乳酸菌干预后的胶束溶液，其透光率显著下降（从73.70%降低到60.51%～66.51%）（P＜0.05），说明乳酸菌破坏了胆固醇胶束的形成。目前已知胆固醇胶束的形成与胆汁盐、卵磷脂以及胆固醇密切相关[24]。本实验结果可能是由于乳酸菌细胞膜结合了胆盐以及胆固醇，从而破坏了胆固醇胶束的形成。

图6 乳酸杆菌对体外胆固醇胶束形成的影响（n＝3）Fig. 6 Effect of lactobacilli on cholesterol micelle formation in vitro (n = 3)

3 讨 论

中国东北的传统发酵食品作为东北地区居民必不可少的食物[26]，同样也是分离益生性乳酸菌的主要来源[27]。本实验从黏面子、辣白菜、辣酱中分离出的乳酸菌品种丰富，其中主要有乳杆菌属、明串珠菌属、链球菌属等。本研究从体外评估了分离自上述食物中的乳酸菌的清除胆固醇的能力，其中有57 株菌株具有40%以上的清除率，这些菌株均为植物乳杆菌。期中，菌株C2、H6、L22具有较高的胆固醇清除能力，其清除率均在90%以上，明显高于之前的文献报道（30%～75%）[11,13,28]。由于菌株T19的清除率较低（20.7%），故在本研究中将其作为阴性对照菌株阐明优良菌株的降解机制。

本研究结果表明，具有高降解率的菌株会产生高的共沉淀效应，沉淀的胆固醇约占总胆固醇的5.50%左右，且菌株在甘氨胆酸钠存在的条件下降解作用更高。在混合胆汁盐的条件下降解效率低于甘氨胆酸钠条件，原因可能是由于牛磺胆酸钠的存在会对甘氨胆酸钠的水解造成一定的影响[18]。实验结果表明胆固醇的共沉淀低于总清除率的5%，并且最终pH值在3.99～4.31之间，即使将pH值控制在2.0左右的时候，共沉淀效应仍没有明显的加强（结果未显示）。这说明共沉淀不是人体去除胆固醇的主要方式，因为人体肠道中的pH值高于6.0，共沉淀效应很少发生[29]。BSH活性与产生共沉淀效应以及总胆固醇的清除率均有相关性。本研究中，菌株H6在甘氨胆酸钠为底物时具有最高的BSH活性（3.27±0.43）U/mL。阴性对照组菌株T19在体外胆固醇清除率、BSH活性以及共沉淀方面均显著低于受试的6 株菌株（P＜0.05），这说明并非所有乳酸菌均具有良好的胆固醇降解能力，降胆固醇能力即使在同一种属内也具有明显的菌株特异性。虽然BSH受到多种基因共同调控[30]，但本研究结果表明，bsh1基因的表达最为活跃，推测其在植物乳杆菌BSH合成过程中起到主要作用。为了进一步探究乳酸菌细胞膜对胆固醇是否有吸附作用，本研究采用超声裂解和热裂解两种方式评价了细胞膜裂解产物对胆固醇的吸附作用。结果表明，裂解后的细胞碎片对胆固醇仍有吸附作用，但这种吸附作用低于完整细胞状态。本研究最后采用模拟人的肠道环境进行了胆固醇胶束的配制，结果表明在乳酸菌存在的情况下，胶束的形成受到了抑制。胆固醇胶束对于脂肪类物质的吸收起到至关重要的作用，因此，抑制胆固醇胶束的形成就可以起到降低胆固醇在肠道内的吸收。

阴性对照菌株T19主要在BSH活性、bsh基因的表达量以及抑制胶束形成方面与其他6 株菌产生了显著差异（P＜0.05），而在胆固醇吸附实验中表现的差异不显著，其原因可能是胶束的抑制作用同样是通过膜的吸附及BSH作用。因此，虽然植物乳杆菌可以通过多种机制清除胆固醇，但其BSH活性是影响清除固醇能力的主要因素。

4 结 论

从东北传统发酵食品中分离的植物乳杆菌H6具有最高的清除胆固醇能力，并且降解机制主要通过胆固醇与细胞膜的结合、胆固醇胶束的破坏、胆汁盐的解离以及BSH活性清除胆固醇，且BSH为主要因素。菌株H6可以作为降低人体胆固醇的潜在后选菌株。后续还需要进行动物实验进一步确定H6的体内降胆固醇特性。