产甲壳素酶菌株的筛选、鉴定及其酶解产物分析

徐田甜，陈 彬，侯是媛，曹 丹，许晨磊，齐 斌，郑丽雪，王立梅,,*

（1.苏州大学医学部药学院，江苏 苏州 215123；2.常熟理工学院发酵工程技术研究中心，江苏 常熟 215500）

甲壳素又名几丁质，是由β-(1,4)糖苷键连接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖高分子多聚体，广泛存在于自然界中，储量仅次于纤维素[1-2]。甲壳素不溶于水，在甲壳素酶的作用下可分解成水溶性甲壳低聚糖或壳寡糖。甲壳素低聚糖具有抑菌、抗氧化、促进动植物生长发育等多种功能[3-6]。Ouyang Qianqian等[7]研究发现神经炎症和氧化应激可能导致阿尔茨海默病，而壳聚糖、壳寡糖具有显著的抗神经炎症以及抗氧化作用，未来可能广泛应用于阿尔茨海默病的治疗。Xu Qingsong等[8]研究发现壳寡糖具有显著的抗肿瘤活性，由壳寡糖制备成的高度N-乙酰化壳寡糖能显著抑制脂多糖诱导的促炎细胞因子白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α表达。另外甲壳素的分解产物在食品和农业上具有广泛的应用前景[9]。

甲壳素酶主要产自微生物，包括芽孢杆菌、链霉菌、黏质沙雷氏菌以及假单胞菌等[10-13]。近年来，研究者通过随机诱变、定点诱变以及改变筛选策略等方法获得高产或具有特殊性质的甲壳素酶菌株，如耐冷、耐热以及耐酸碱甲壳素酶等[14-17]。麻虾酱是由产自海洋的麻线虾加盐，经过自然发酵制得的富含蛋白质、甲壳素的调味料，是我国及东南亚地区常见的传统食品[18-20]。传统麻虾酱中微生物多样性和构成非常复杂[21]，适合用作产甲壳素酶菌株的筛选，目前还鲜见从麻虾酱中筛选产甲壳素酶菌株的报道。

本实验以麻虾酱为原料，筛选高产甲壳素酶的微生物菌株，通过酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法测定其甲壳素酶活，并利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）联用技术对该菌株发酵液中成分进行检测，以期筛选到高产甲壳素酶的菌株，为工业化生产壳寡糖提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麻虾酱 连云港市海娃食品有限公司；甲壳素与细菌DNA基因组提取盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲壳素酶ELISA检测试剂盒 武汉纯度生物科技有限公司；Chitosan标准品 日本Seikagaku公司；其他试剂均为市售分析纯。

初筛培养基[22]：A液：K2H P O41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、NaCI 10 g/L、(NH4)2SO420 g/L、琼脂40 g/L，去离子水1 000 mL，pH 6.5；B液：10 g/L 胶体甲壳素。使用前等体积混合。

复筛培养基[22]：A液：K2H P O41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、NaCl 10 g/L、(NH4)2SO420 g/L，去离子水1 000 mL，pH 6.5；B液：10 g/L 胶体甲壳素，pH 6.5。使用前等体积混合。

种子培养基：PDA。

胶体甲壳素的制备方法参照文献[23]：将片状甲壳素粉碎过筛，称取10 g粉末甲壳素缓缓加入浓盐酸200 mL，迅速搅拌，待其全部溶解后用玻璃棉过滤除去杂质，溶液加入1 000 mL蒸馏水。离心得到沉淀，用蒸馏水洗至中性。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-ZF超净工作台 苏州净化设备有限公司；HZQ-F280恒温振荡培养箱 太仓市华美生化仪器厂；XS105DU电子天平、DYY-6C pH计 瑞士Mettler Toledo公司；legend micro 17R台式高速冷冻离心机、NanoDrop 2000核酸浓度测定仪 德国Thermo公司；WGL-230B电热恒温鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；My Cycler PCR基因扩增仪、DYCP-31BN琼脂糖水平电泳槽、Gel Doc XR凝胶成像系统、酶标仪 美国Bio-Rad公司；UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；MILI-QADVANT超纯水仪 美国Millipore公司；3-30K高速台式离心机 美国Sigma公司；UPLCQ-TOF-MS仪 美国Waters公司；ZEISS SIGMA热场发射扫描电子显微镜 德国卡尔蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 初筛

称取25 g虾酱与225 mL生理盐水制备菌悬液，同时将其质量浓度稀释至10-1、10-2、10-3g/mL和10-4g/mL。将原液和上述稀释的菌液涂布于初筛培养基上，37 ℃生长1～7 d后挑取生长良好的单一菌落在初筛培养基上划线分离。

1.3.2 复筛

挑取初筛培养基上生产的周围有明显透明圈的单一菌落接种到液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养1～7 d。

1.3.3 ELISA法酶活测定

将发酵液3 000 r/min离心10 min，取上清液为待测样品。往预先包被甲壳素酶抗体的包被微孔中，依次加入待测样品、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的检测抗体，经过37 ℃温育1 h并彻底洗涤。用底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺显色，在HRP催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化为最终的黄色。用酶标仪在450 nm波长处测定OD值，通过标准曲线计算样品活性。标准品为纯甲壳素酶配制的酶活性为0、1.5、3、6、12、24 U/L酶溶液。酶活定义为：37 ℃条件下，每毫克蛋白每小时分解甲壳素产生1 mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位U。具体操作步骤参考说明书。

1.3.4 菌种鉴定

1.3.4.1 形态学鉴定

平板划线、革兰氏染色和电镜观察法观察菌落和菌体形态。参照文献[24]，采用简便快速的插片法制样，直接喷金后进行扫描电镜观察。

1.3.4.2 生理生化鉴定

根据文献[25-27]进行生理生化鉴定。

1.3.4.3 分子生物学鉴定

以16S rDNA细菌通用引物扩增，将扩增片段送至生工生物工程（上海）股份有限测序，将测序得到的基因序列在NCBI上进行BLAST比对，利用软件MEGA5.1构建N-J系统进化树。

1.3.5 发酵液可溶性糖成分分析

1.3.5.1 Chitosan标准品溶液配制

称取标准品壳二糖3.8 mg、壳三糖4.9 mg、壳四糖4.3 mg、壳五糖7.0 mg和壳六糖7.0 mg溶于10 mL容量瓶中。

1.3.5.2 UPLC条件

采用BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）柱，柱温45 ℃，进样量2 μL。流动相A：体积分数80%乙腈和体积分数0.1%氨水，流动相B：体积分数30%乙腈和体积分数0.1%氨水。流动相梯度稀释见表1。

表1 流动相梯度稀释Table 1 Mobile phase gradient elution program

1.3.5.3 质谱条件

采用电喷雾电离源，在正离子电离模式下进行质谱分析。毛细管电压3.5 kV，锥孔电压20 V。离子源温度100 ℃，脱溶剂温度400 ℃，脱溶剂流速700 L/h，锥孔反吹气流量50 L/h，碰撞室能量6 V，四极杆扫描范围m/z200～2 000。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

图1 X1菌株形态学鉴定图Fig. 1 Morphological identification of strain X1

经过初筛复筛后，筛选到1 株X1菌株。由图1可见，30 ℃培养5～7 d后，X1菌株在以甲壳素为唯一碳源的初筛培养基上长出透明圈（图1A）。菌落呈圆型，干燥，粗糙，凸起，粉末状，较易挑起，无色素，有明显的土霉气味。挑取菌落，经革兰氏染色后显微镜观察（图1B），该菌为革兰氏阳性菌。由1C、D电镜观察图可知，X1菌株孢子表面光滑，为卵圆形，孢子链为直行或卷曲。

2.2 生理生化鉴定

2.2.1 生理生化实验结果

表2 X1菌株的生理生化实验Table 2 Physiological and biochemical properties of strain X1

由表2可见，该菌具有纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶活性，同时能使牛奶缓慢胨化，其VP、MR实验结果为阴性。X1菌株在30 ℃、pH 6.5条件下生长良好。

2.2.2 碳源利用实验结果

表3 X1菌株碳源利用实验Table 3 Carbon source utilization ability of strain X1

由表3可见，除木糖、果糖和山梨糖外，该菌可利用其他10 种碳源，其可分解甲壳素、壳聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖，可初步推断该菌所产甲壳素酶为酶系，可能包含甲壳素酶、甲壳素脱乙酰酶、壳聚糖酶等。

2.3 分子生物学鉴定

2.3.1 PCR扩增产物电泳图

图2 PCR扩增产物电泳图Fig. 2 Electrophoretogram of PCR amplification products

由图2可知，以X1菌株DNA为模板，利用细菌通用引物菌株的16S rDNA基因，将PCR产物进行质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳，获得1 500 bp左右扩增片段，并将1 500 bp左右的条带切胶回收后送sanger法测序。

2.3.2 系统进化发育树

图3 X1菌株系统进化发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of strain X1

经NCBI上BLAST比对后，系统进化树（图3）显示该菌可确定为链霉菌属，且与淀粉酶链霉菌同源性较高，高达99%以上。结合菌落的特征、形态学、生理生化实验和16S rDNA基因序列分析，可确认本实验所筛选到的菌株属于淀粉酶链霉菌亚种，命名为S. diastaticus strain CS 1801。在最适条件（30 ℃、pH 6.5）培养7 d后，发酵液中甲壳素酶活力可达117.4 U/L。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS分析

2.4.1 UPLC分析

图4 标准品（A）与发酵液（B）UPLC图Fig. 4 Ultra-high performance liquid chromatograms of standard (A)and fermentation broth (B)

由图4A可知，壳寡糖标准溶液具有壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖5 种不同分子质量的寡糖成分，在5.09、6.82、8.29、9.59、10.60 min分别出现吸收峰，对应的应为分子质量由小到大的壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖。

由图4B可知，发酵7 d后的发酵液样品，在5.15、6.78、8.29、9.56、10.58 min出现吸收峰，与标准品的出峰时间基本一致，由此发酵液中很有可能含有壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖。

2.4.2 质谱分析

图5 标准品与发酵液质谱分析Fig. 5 Mass spectra of standard and fermentation broth

由图5A可知，壳寡糖标准品UPLC 5 个峰对应的质谱主要分子离子峰为m/z 341.2、502.2、663.3、824.4、985.5，其m/z值依次相差约161，这与氨基葡萄糖的残基吻合，其依次属于壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖的[M＋H]＋峰[28-31]。由图5B可见，发酵液的UPLC的5 个峰对应的主要分子离子峰也为m/z 341.2、502.3、663.4、824.5、985.6。这与壳寡糖标准品的质谱图结果高度一致。

结合UPLC-Q-TOF-MS结果可以判定，甲壳素酶发酵液中含有5 种不同聚合度的壳寡糖，分别为壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖。

3 结 论

本实验以甲壳素为唯一碳源从麻虾酱中筛选到1 株产甲壳素酶的菌株，经鉴定为淀粉酶链霉菌，除甲壳素酶外还产脂肪酶、淀粉酶等多种工业酶，同时实验还研究了发酵液中可溶性糖的成分。本实验得出两个结论：1）筛选到1 株产甲壳素酶的菌株，鉴定后为淀粉酶链霉菌，复筛培养基发酵7 d后酶活力为117.4 U/L。2）经技术检测证实，发酵液中产壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖。发酵液中5 种糖分子质量分别为 341.2、502.3、663.4、824.5、985.6 Da，与标准品高度吻合。

目前，壳寡糖因其抑菌、抗肿瘤、降血脂等生物活性已被广泛应用于食品、生物医学和制药领域。与甲壳素和壳聚糖不同，壳寡糖具有良好的溶解性[32-34]。因此，低聚合度的壳寡糖的生产越来越受到人们的重视。而我国目前对酶法发酵产低聚合度壳寡糖的研究还相对较少，因此本研究为酶法工业化产低聚合度的壳寡糖提供了良好的参考依据，将大大推动其工业化发展进程。