犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究

梅朱园，邬 琴，柴迎锦，顾晓晓，陶乔孝慈，钟发刚，韩猛立，黄 新，周 霞，张星星

（1.石河子大学动物科技学院，石河子832003；2.新疆农垦科学院 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，石河子832000）

随着新疆畜牧业的发展，牛呼吸道感染疾病也逐渐成为影响牛群健康的重要疾病之一。除了环境等外界因素外，细菌性病原也是牛呼吸道感染疾病发生的主要原因，其中多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）则是引起犊牛肺炎分离率较高的病原[1]。

细菌分型在研究菌株之间关系，确定感染源和控制病原菌的流行以及制定有效的防控措施等方面具有重要意义。对临床分离的巴氏杆菌采用不同方法进行分型也是制定有效防控措施的重要依据之一。依据荚膜抗原将Pm分为5种血清型的Carter分型方法[2]，以及依据脂多糖抗原将Pm分为16种血清型的Heddleston分型方法[3]等均属常规血清分型方法，对抗血清浓度、滴度和特异性等要求较高，不适合临床快速开展大规模Pm流行病学调查。随着分子生物学技术的发展，研究人员建立的多重PCR和多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）方法具有操作简单、灵敏、快速等特点。Townsend等[4]基于Pm荚膜编码区基因的特有序列建立了快速鉴定Pm荚膜血清型PCR技术，与Carter分型结果相符。研究人员针对Pm脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）合成中的8个特异性基因位点，建立的多重PCR方法，可将各血清型划分为不同的L型[6]。MLST是用于微生物分型、进化和流行病学监测等研究的一种简便可行的方法，它是对多个管家基因内部片段进行PCR扩增测序，从而分析细菌种群之间的演化和变异关系[7-9]。目前国内Pm的基因多样性和流行病学调查不够全面，引起犊牛肺炎的Pm分离株的相关报道很少。因此本研究在对8株Pm分离株进行kmt基因型鉴定的基础上，分别采用荚膜特异性基因检测、MLST和脂多糖多重PCR 分型分析，确定分离株血清型和基因型，为Pm引起犊牛肺炎暴发的流行病学监测和基因多样性研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种及试剂8株巴氏杆菌分离自新疆建设兵团第八师不同农牧团场，由省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室保存，分别命名为122-1、P3、F1、F2、Y、142-1、AS、X2；2×EsTaqMaster Mix等试剂均购自康为世纪生物科技有限公司；PDM19-T、DH5α感受态细胞购自宝生物工程有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，DNA Marker DL 2000购自天根生物工程有限公司。

1.2 引物设计与合成参照文献[10]荚膜血清型和脂多糖引物设计，Pm特异性基因kmt序列设计引物以及特定的MLST分型引物（相应的扩增及测序引物序列参见Pasteurella multocidaMLST Databases网站），送北京睿博兴科生物技术有限公司合成（表1）。

1.3 菌株荚膜多重PCR分型以细菌基因组为模板，通过多重PCR方法对分离株血清型进行鉴定，对扩增产物测序并与数据库数据比对。反应扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行验证。PCR体系：DNA模板1 μL，5种引物上、下游引物分别加入0.4 μL，Mix 10 μL，ddH2O 5 μL，共20μL。扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min10s，30个循环；72℃再延伸10 min，4℃保存。

1.4 菌株脂多糖多重PCR分型以细菌基因组为模板，筛选反应条件对分离株进行 LPS-mPCR 扩增，并对产物进行测序用于LPS分型。反应体系：DNA模板1 μL，5种引物上、下游引物分别加入0.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，共25 μL。扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min20 s，30个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行验证。

1.5 MLST分型及遗传演化分析对8株分离菌的7个管家基因gdhA、mdh、adk、deoD、pgi、g6pd和aroA进行PCR扩增，扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。将测序的每个基因的序列与MLST数据库比对，得到相应的等位基因编号，按照指定顺序形成ST型。用MEGA7.0软件构建系统发育树，分析分子进化关系。

2 结果

2.1 菌株荚膜血清型的鉴定8株菌中AS、122-1、X2、142-1、F1、F2、Y共7株检测到了A型特有的1044 bp条带，P3扩增出现B血清型特有条带（760 bp）（图1）。

表1 多杀性巴氏杆菌kmt基因鉴定、荚膜血清分型、LPS基因型分型所用引物Table 1 Primers for identification of Pm, capsular serotyping and LPS genotyping

图1 分离Pm的荚膜血清型鉴定结果Fig.1 Identification of capsular serotype of isolated Pm

2.2 菌株LPS基因型的鉴定 通过LPS-m PCR对8株菌脂多糖基因型分型，8株菌中共7株（AS、122-1、X2、F1、F2、142-1和Y）扩增出大约474 bp的条带，属于脂多糖L3型，1株（P3）扩增条带约810 bp，属于脂多糖L2型（图2）。

2.3 MLST分型及遗传演化分析 8株Pm有7株序列类型为ST1，1株菌序列类型为ST44。利用MEGA 7.0软件对本研究中2个ST型与MLST数据库中的部分ST型进行分析，结果表明，ST1与ST44亲缘关系较近，在同一分支上，与数据库中其他ST型亲缘关系较远（图3）。

3 讨论

Pm能导致牛出血性败血症，犊牛多表现为高热、肺炎等疾病，可造成养牛业巨大的经济损失。根据荚膜抗原Pm可分为A、B、D、E及F五个血清型，不同血清型引起不同动物发病，并且各血清型间缺乏交叉免疫保护作用[11-13]，因此对Pm的荚膜血清型分型以及对不同来源菌进行遗传演化分析尤为重要。本研究采用多重PCR对Pm荚膜血清型和LPS基因型进行分型，可快速确定这8株菌的荚膜型和LPS基因型，加入多对引物时避免漏加或重复。采用MLST的方法，对这8株菌的管家基因进行PCR扩增，确定ST型，分析细菌的进化关系，结果准确，操作简便[10]。

图2 分离Pm的脂多糖基因型鉴定结果Fig.2 Identification of LPS genotype of isolated Pm

图3 MLST系统进化树分析结果Fig.3 MLST Phylogenetic tree of isolated Pm

表2 Pm荚膜血清型、LPS分型以及ST分型结果Table 2 Capsular serotypes, LPS types and ST genotyping of Pm in this study

Ewers等[14]将从不同宿主分离的289株Pm进行荚膜分型，结果表明大部分禽源和牛源Pm为血清A型。2009～2012年，日本学者报道的378株牛源Pm以荚膜A型为主[15]。在中国，以往流行的牛巴氏杆菌病主要为荚膜B型Pm引起的牛出血性败血症（败血型和肺炎型），对养牛业造成严重危害。近年来，由于针对荚膜B型Pm灭活疫苗具有良好的免疫效力，该病在中国已得到了有效的控制[16]。2008年，马文戈等[17]首次报道牛源荚膜血清A型Pm感染导致牛群发病，呈现高发病率和高死亡率，其临床症状、病理变化和流行特点与国外报道的牛巴氏杆菌肺炎相似。随后，国内研究人员也相继报道了牛源A型Pm[18-20]。本研究分离的8株Pm中7株为荚膜血清A型，1株B型，这与近年来国内外报道的牛源Pm优势荚膜型相一致，说明荚膜A型Pm是目前牛巴氏杆菌病病原的优势血清型。

研究表明，荚膜A型Pm并不能侵入牛的血液系统形成败血症，病理变化仅局限于肺脏，这与牛出血性败血症有本质区别[21,22]，所以荚膜A型Pm引起的牛巴氏杆菌病被定义为牛纤维素性化脓性肺炎（简称牛荚膜A型巴氏杆菌肺炎）[23]。目前，临床上使用的Pm商业疫苗的菌株多为B型Pm，仅用于预防牛出血性败血症。由于Pm不同血清型间的交叉保护较差[20]，因此，研制牛荚膜A型巴氏杆菌肺炎疫苗迫在眉睫。

研究人员对不同宿主来源的58株Pm进行脂多糖分型，结果显示主要LPS基因型为L3、L4和L6[6]。王豪男[24]对来自于我国14省的115株猪源Pm的LPS基因型进行分析，发现分为L3和L6两种，荚膜型D型的菌株，其LPS基因型均为L6型。本研究中8株Pm的LPS型为L2和L3两种，其中荚膜血清型A型菌株LPS基因型均为L3（表2）。

调查结果显示，2011～2012年在江苏省分离的40株禽源Pm经MLST分析均为ST129型[9]。2015～2016年我国不同省分离的23株猪源Pm分为3个ST型，即ST3、STl0和STll[24]。本研究对8株Pm的7个管家基因进行测序比对，获得2个ST型，分别为ST1和ST44，有7株以ST1为主。8株菌分别来自5个不同的牛场，其中P3来自136团，其荚膜血清型、LPS基因型和ST型与其他7株菌不同（表2），说明导致犊牛肺炎的主要流行菌株血清型为A:3、ST1型，且Pm荚膜血清A型、LPS基因3型和ST1型之间可能存在一定的关联性。从MLST系统进化分析结果，ST1型和ST44的亲缘关系较近（图3）。由于本调查中菌株数量较少，因此对于MLST结果需要更多菌株进行验证。