N-磷酸化修饰蛋白质的富集和鉴定方法

胡晔晨, 江 波, 张丽华*, 张玉奎

(1. 中国科学院分离分析化学重点实验室, 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023; 2. 中国科学院大学, 北京 10049)

自1906年被首次报道以来,蛋白质磷酸化修饰作为关键调节因子受到了越来越广泛的关注[1,2]。到目前为止,发现约有30%的人类蛋白质可能在某些时刻被磷酸化,约500种蛋白激酶和少量的蛋白磷酸酶调节着磷酸化过程[3]。同时,蛋白质的磷酸化能够影响诸多生理过程,包括免疫反应、内分泌作用、神经机制和行为、胃肠道行为和肌肉骨骼调节等[4]。此外,由于激酶或磷酸酶突变导致的异常磷酸化会引起一些信号通路的异常,成为某些疾病发生的诱因[1,5]。

除了众所周知的蛋白质O-磷酸化修饰,即磷酸化发生在丝氨酸(pSer)、苏氨酸(pThr)和酪氨酸(pTyr)的侧链羟基上外,还有一类发生在碱性氨基酸——组氨酸(pHis)、精氨酸(pArg)和赖氨酸(pLys)的侧链氨基上,称为N-磷酸化修饰[6]。由于其在信号转导方面发挥重要的生物学功能,越来越受到人们的关注[7]。然而,由于其特殊的化学不稳定性质,目前针对蛋白质N-磷酸化修饰的研究仍处于初级阶段。本文针对蛋白质N-磷酸化修饰的特性与功能,以及富集和鉴定方法进行了综述。

1 蛋白质N-磷酸化修饰的特性与功能

1.1 蛋白质N-磷酸化修饰结构及其化学性质

蛋白质中发生N-磷酸化修饰氨基酸的化学结构如图1所示。与O-磷酸化修饰中的P-O键相比,N-磷酸化修饰中的P-N键水解的吉布斯自由能(ΔG°)较高。例如pHis的氨基磷酸酯键水解释放的能量(ΔG°为-12.0～-13.0 kcal/mol)约为pSer、pThr或pTyr的磷酸酯能量(ΔG°为-6.5～-9.5 kcal/mol)的两倍[8,9],因此热力学稳定性较差。此外,氨基磷酸酯在动力学上也不稳定。氮原子的孤电子对和磷酰胺π键重叠较少,P-N键不能形成像P-O键一样稳定的电子离域结构,因此在酸性条件下P-N键的氮的质子化促进了磷酰基的解离,从而容易发生去磷酸化[10,11]。N-磷酸化修饰的不稳定性给其分析带来了巨大的挑战。

图 1 蛋白质N-磷酸化修饰的化学结构Fig. 1 Chemical structures of protein N-phosphorylation

1.2 蛋白质N-磷酸化修饰的发现及其生物学功能

在蛋白质N-磷酸化修饰中,pHis是研究最为成熟的。根据咪唑环上磷酸化位置的不同,pHis具有1-pHis和3-pHis两种异构体。Boyer等[12,13]最先在大鼠肝线粒体中发现了pHis蛋白质。尽管在原核细胞中pHis修饰的丰度(约6%)高于pTyr(约1%)[8,14,15],但哺乳动物中有关pHis的报道较少。哺乳动物的第一个磷酸化组氨酸磷酸酶直到2002年才被鉴定[16,17]。现有研究表明,pHis在细菌、真菌和植物中的双组分和多组分磷酸信号传导途径中起主要作用[8,18,19]。随着生物化学和质谱技术的发展,人们发现pHis对哺乳动物很多细胞生命过程,如信号传导、染色质组装和离子传导等,都有重要影响。目前已知NME1和NME2是哺乳动物的两个pHis激酶[20],而LHPP是对应的pHis磷酸酶[21]。

与pHis类似,pArg主要存在于细菌等原核生物中。在1994年对蛋白质精氨酸激酶McsB进行分离和鉴定后,Wakim等[22]首次证实了原核生物中pArg的存在。2009年,Clausen等[23]发现McsB在枯草芽孢杆菌转录调节中具有重要作用。随后,最初被认为是pTyr磷酸酶的YwlE被发现为pArg磷酸酶,在细菌和黑腹果蝇pArg调节中发挥作用[23-25]。最新研究表明,pArg是受损原核蛋白诱导蛋白水解的标记物[26]。然而,McsB在真核生物中的作用尚未完全阐明[27]。

相比于pHis和pArg, pLys的研究相对较少,因此它的生物学意义仍然不明确。到目前为止,pLys仅在再生大鼠肝脏中的组蛋白H1上发现[28]。研究人员从活细胞中分离出几种激酶和磷酸酶,并且暗示它们对赖氨酸的磷酸化起到调节作用[29-31]。由于具有相似的化学性质和稳定性,因此推测pLys可能具有与pHis和pArg类似的作用。

综上所述,尽管蛋白质N-磷酸化在原核生物中的功能报道较多,但目前在哺乳动物中的研究仍亟待深入。

2 N-磷酸化蛋白质/肽段的富集方法

由于生物样本中蛋白质N-磷酸化的丰度低,质谱信号易受高丰度组分抑制[32],因此对N-磷酸化蛋白质/肽段进行有效富集已成为提高其检测灵敏度的必要和关键步骤[33]。目前,N-磷酸化蛋白质/肽段的富集方法主要包括抗体法、固定化金属亲和色谱法和色谱保留时间差异法等。

2.1 抗体法

与O-磷酸化蛋白质/肽段不同,抗体法是富集N-磷酸化蛋白质/肽段最常用的方法。主要原因是,抗体-抗原的特异性结合可以在温和条件下实现,不会破坏N-磷酸化修饰。然而,与其他抗体相比,获得N-磷酸化氨基酸的抗体十分困难。这是因为如果利用N-磷酸化氨基酸本身或含有N-磷酸化氨基酸的肽段作为抗原,它们在注射到动物体内后,在溶酶体加工过程中会被快速去磷酸化[10,11]。因此,研究人员探索了利用替代抗原表位来获得可以与N-磷酸化氨基酸交叉反应的抗体[34]。

2.1.1抗pHis抗体

最近,研究人员合成了pHis的稳定类似物[35,36],用其代替pHis注射到动物体内,以实现免疫反应,获得抗pHis抗体[37]。

图 2 (a)pHis的类似物与(b)3种合成肽文库的结构,其中His或稳定的pHis类似物(6或7) 被随机地插入中性氨基酸(丙氨酸和甘氨酸)中Fig. 2 (a)Analogues of pHis and (b) structures of the three synthetic peptide libraries used in which either His or a stable pHis mimetic (6 or 7) is flanked by randomized, neutral amino acids (alanine and glycine)

Kee等[38]分别合成了三唑类化合物1和2作为3-和1-pHis类似物(见图2a)。密度泛函理论(DFT)计算表明1与3-pHis的结构匹配,但1中额外的氮和孤对电子周围的表面电位与3-pHis的具有差异[39]。将两种类似物通过SPPS方法合成于肽段中,并与KLH蛋白结合后用于抗体的制备[38]。受到单独使用半抗原产生pTyr抗体工作的启发,Kee等[40]通过使用连接头将三唑基乙胺3与KLH结合来产生抗体(见图2a);纯化的抗体可以用于检测各种已知的pHis肽段,但是通过ELISA和斑点印迹实验观察到,其与pTyr具有显著的交叉反应[40]。该团队将这个抗体应用在E.coli裂解液中pHis蛋白质的富集中,从两种培养条件下(甘油和甘露醇)鉴定到16个pHis位点[41],并发现这些蛋白质在大肠杆菌的代谢和信号转导中发挥重要作用(见图3)。然而,由于该抗体富集选择性有限,且鉴定方法依赖于MS的中性丢失信息,因此导致pHis肽段的鉴定数目较少。

随后,Kee等[39]报道了采用吡唑乙胺4作为3-pHis类似物(见图2a)制备第二代pHis抗体:DFT计算表明,吡唑类似物4不仅与3-pHis结构匹配,而且电子结构也匹配;发现纯化的多克隆抗体检测pHis的响应远远高于pTyr;他们将此多克隆抗体用于检测各种体外pHis蛋白质,包括PGAM1、哺乳动物组蛋白H4和PtsI。同时,Lilley等[42]报道了戊二醛接头与吡喃氨基酸5结合的抗体(见图2a);发现这种多克隆抗体对pHis的响应同样远远高于pTyr,并将抗体成功用于检测免疫沉淀蛋白质Gβ和来自HBE细胞的NDPK-A/B。

2015年,Fuhs等[43]制备出抗pHis的单克隆抗体。他们将6和7分别添加进中性肽库中形成两类多肽抗原(见图2b),并结合KLH蛋白来引起免疫反应。免疫印迹分析显示,这两种抗体能够分别特异性地识别3-和1-pHis而不产生交叉反应[43]。他们将该单克隆抗体用于哺乳动物全细胞裂解物的蛋白质印迹和pHis蛋白质富集,鉴定到了包括NME家族PGAM、SCS、ACLY等重要的pHis蛋白质[43]。然而,由于未采用LC-MS/MS进行鉴定,鉴定到的pHis蛋白质数目较少。

图 4 抗pArg抗体的开发策略[45]Fig. 4 Strategy to develop anti-pArg antibodies[45] KLH: keyhole limpet hemocyanin.

2.1.2抗pArg抗体

相对于抗pHis抗体,由于Arg具有更加柔性的侧链,针对抗pArg抗体的研究较少。Fuhrmann等[44]采用体外噬菌体展示方法产生靶向含pArg肽段的抗体。虽然这种抗体可用于重组蛋白的体外研究,但它对pArg的低亲和力阻碍了其在细胞研究中的应用。为了解决这个问题,并获得高亲和力的pArg特异性抗体,该团队[45]合成了酸稳定的pArg类似物PO3-amidine和SO3-amidine(见图4),进而制备了不依赖序列的高亲和力抗pArg抗体,并使用这种抗体检测细胞裂解液中的两种pArg蛋白——ClpC和GroEL。同样,赵玉芬院士团队[46]也合成了类似的分子,用于pArg抗体的制备。

虽然抗体法是目前最经典的N-磷酸蛋白质/肽段富集方法,但是也存在许多问题。除了抗体种类少和价格昂贵之外,更重要的是它们具有肽段序列偏向性,只对某一类N-磷酸化具有识别作用。此外,目前针对pLys的抗体尚未见报道。这些都限制了其在规模化N-磷酸化蛋白质研究中的引用[47]。

2.2 固定化金属离子亲和色谱

固定化金属离子亲和色谱(IMAC)将金属离子通过与配体配位的方式固定在基质上,再通过金属离子与磷酸根的特异性结合形成稳定的复合物,最后以竞争性洗脱的方式实现含磷酸根分子的富集。因此,IMAC材料不仅被广泛用于O-磷酸化肽的富集,而且也被尝试用于N-磷酸化肽的富集。Muimo等[48]用含Fe3+和Ca2+的IMAC材料富集pHis膜联蛋白A1,但在pH 5.0的条件下选择性有待提高。Napper等[49]利用含Cu2+的IMAC材料从大肠杆菌裂解液中选择性富集到了含有pHis的HPr蛋白。最近,Potel等[50]利用Fe3+-IMAC亲和柱,在pH 2.3的弱酸条件下从大肠杆菌中富集到了135个高可信的pHis位点,是目前报道的最大的细菌pHis数据集。然而,由于在pH 2.3的条件pLys蛋白质的磷酸根更易脱落,因此对该类蛋白质的富集效率很低。

目前,基于IMAC的N-磷酸化蛋白质/肽段的富集方面仍存在挑战。这是由于该方法需要在酸性条件下富集,因此会导致在酸性条件下不稳定的N-磷酸化蛋白质/肽段易发生水解而影响富集效率。因此,亟须发展能够在中性条件下富集N-磷酸化蛋白质/肽段的方法。

图 5 (a)ReDD策略的流程图和(b)pLys肽段发生的化学过程[52]Fig. 5 (a) Flowchart of retention time difference combining dimethyl labeling (ReDD) strategy and (b) chemical process of pLys peptide[52] FA: formic acid; SCX: strong cation exchange chromatography.

2.3 基于色谱保留时间差异的富集方法

针对pLys丰度低、目前缺乏富集抗体的问题,我们根据pLys肽段和其相应的去磷酸化肽段的疏水性不同,进而在高pH反相色谱[51]保留能力上存在的差异,发展了一种pLys肽段的富集方法(简称ReDD,见图5)[52]。此外,还结合二甲基化标记来控制鉴定结果的假阳性。利用该方法,可以从1 000 000倍质量比干扰肽段的存在下实现pLys肽段的选择性富集。此外,还从HeLa细胞裂解液中富集到100个pLys蛋白质。Gene ontology (GO)分析表明,大多数pLys蛋白质在代谢调节、细胞定位、RNA加工等功能方面高度富集。此外,这些pLys蛋白质还参与细胞代谢、分解代谢和调节RNA加工等重要的生物学过程。

为提高样品富集的回收率,我们进一步利用pLys肽段的酸不稳定性,发展了一种可断裂疏水性衍生方法(简称HCD),实现了pLys肽段的选择性富集[53]:如图6所示,经过酸处理后,pLys肽段产生新的侧链仲氨基;对其用可断裂疏水性衍生试剂(Dec-disulf-NHS)衍生后,利用反相色谱进行富集;最后利用二硫键还原反应将其还原断裂,并采用nanoLC-MS/MS进行鉴定;此外,我们还结合二甲基化标记和针对错误位点的“排除策略”来控制假阳性率。利用该方法,从大肠杆菌中鉴定到39个pLys位点,对应35个pLys蛋白质。这些蛋白质在核糖体、糖酵解/糖异生和次生代谢产物的生物合成中发挥重要作用,并参与了分解代谢、代谢、物种起源和生物合成等重要途径。

图 6 (a)CHD策略的流程图和(b)pLys肽段发生的化学过程[53]Fig. 6 (a) Flowchart of cleavable hydrophobic derivatization (CHD) strategy and (b) chemical process of pLys peptide[53] Dec-disulf-NHS: 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl-3-(decyldisulfanyl)propanoate; TCEP: tris(2-carboxyethyl)phosphine.

综上所述,将不稳定的pLys肽段转化成稳定的、具有特殊标记的肽段,并结合HPLC的高分辨率分离,不依赖抗体即可实现pLys肽段的选择性富集和鉴定。

2.4 其他富集方法

此外,还有一些研究者通过生物分子相互作用来实现N-磷酸化蛋白的有效富集。Hofmann等[54]报道了来自Src激酶的SH2结构域可以与pArg肽段结合(Kd=550±150 μmol/L),并通过进一步突变SH2结构域有望实现pArg肽段的有效富集。Trentini等[55]开发了pArg磷酸酶YwlE的突变体,保留了对pArg蛋白质的亲和力;将其用来富集枯草芽孢杆菌Δyw1E细胞提取物中的pArg蛋白质,发现pArg蛋白质在原核细胞的信号传导方面发挥重要作用[55]。但是,此方法只能用于pArg蛋白质的特异性富集,而且YwlE突变体的制备较为繁琐。

3 蛋白质N-磷酸化修饰检测技术

蛋白质组学技术的发展为N-磷酸化修饰蛋白质/肽段的规模化鉴定提供了有力的工具。目前,N-磷酸化蛋白质/肽段的检测主要采用ESI-MS/MS和MALDI-TOF MS。此外,P31NMR也被用于N-磷酸化修饰的检测。

3.1 ESI-MS/MS

目前,虽然利用ESI-MS/MS来检测O-磷酸化修饰的方法已经发展得非常成熟,但是对于N-磷酸化修饰的检测依然存在很大的问题。主要原因不仅是在常规正离子模式下所需的酸性流动相会造成N-磷酸化修饰水解,而且在质谱检测中,N-磷酸化修饰更容易产生中性丢失而难以确定位点信息。此外,由于目前针对pArg和pLys蛋白质/肽段的有效富集方法较少,ESI-MS/MS主要集中于针对pHis的检测。

3.1.1pHis肽段分析

Medzihradszky等[56]发现在正离子检测模式下,利用ESI-MS很少或几乎难以检测到pHis肽段信号,只检测到其相应的去磷酸化的肽段;然而,在负离子模式下,完整的磷酸化肽段可以产生明显信号。此外,Kleinnijenhuis等[57]比较了不同的MS/MS碎裂方法,发现在抑制pHis肽段信号的衰减和增强pHis位点检测方面,电子捕获解离(ECD)、电子脱离解离(EDD)和电子转移解离(ETC)优于碰撞诱导解离(CID),更适合于N-磷酸化肽段的鉴定。这主要是由于当pHis邻近天冬氨酸残基时,CID会导致pHis以H3PO4的形式损失磷酸基团。最近,Bertran-Vicente等[58]发现,pLys在MS检测中会发生磷酸基团的气相转移,导致无法对磷酸化位点进行准确定位。

Cebo等[59]利用pHis和His之间的氘-氢交换(HDX)速率差异,建立了基于MS/MS的pHis肽段鉴定策略,发现对于具有pHis的肽段测量的HDX速率与未修饰的肽段相差约两个数量级,并且序列对HDX动力学的影响可以忽略不计。因此该方法可以被应用于在酸性条件下进行的基于LC-MS/MS的N-磷酸化位点分析中。

3.1.2pHis蛋白质分析

ESI-MS/MS也是检测pHis蛋白质的有效手段。Wind等[60]对完整的重组N-磷酸化CheA-H蛋白进行了ICP-MS/MS分析。虽然MS/MS谱含有大量的y、b离子,然而无法确定N-磷酸化位点,但作者将有可能的位点缩小到30残基和84残基之间[60]。尽管目前针对完整N-磷酸化蛋白质的检测鲜有报道,但是随着蛋白质组学“自上而下”策略的不断发展,相信未来基于ESI-MS/MS的N-磷酸化蛋白质的检测方法会为N-磷酸化蛋白质的研究提供强有力的技术支撑。

3.2 MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS是检测标准N-磷酸化肽段的重要手段。常用的基质是α-氰-4-羟基肉桂酸(CHCA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)和介子酸(SA)。但是这些基质本身都显酸性,且在使用时还需加入0.1%(v/v)增强离子化效率,因此可能会使酸不稳定的N-磷酸化肽段水解。Goman等[61]使用2,6-二羟基苯乙酮和柠檬酸氢铵的混合物作为MALDI-TOF MS的基质来研究不稳定的N-磷酸化肽段,发现与CHCA相比,该基质能够明显增强不稳定肽段的信号响应。Napper等[62]使用MALDI-TOF MS分析了来自磷酸化HPr的酶解产物,观察到正离子模式下pHis的源后衰变现象,而在负离子模式中这种现象则少一些。在另一项研究中,Attwood及同事[63]分析了具有pHis的组蛋白H4的酶解产物,他们通过MALDI-TOF MS观察到了其中的N-磷酸化肽段,并使用ESI-MS/MS确定了磷酸化位点(H18和H75)。

3.3 P31NMR

尽管需要大量纯化的样品,P31NMR是能够利用化学位移区分pHis异构体的主要方法之一。Lecroisey等[64]发现,磷酸化NDPK的P31NMR化学位移与任何已知的1-pHis或3-pHis的P31NMR化学位移均不匹配;pHis残基的化学位移在天然(-2.72)和变性状态(-4.20)间也有很大差异,而1-pHis肽段(Glu-pHis-Gly,已知的NDPK磷酸化序列)与变性状态下的化学位移一致。上述结果说明,利用P31NMR化学位移的差别可以研究N-磷酸化氨基酸残基的不同状态。

3.4 其他检测方法

Wei和Matthews[65]开发了一种基于膜的方法,用于检测pHis;即在常规的激酶测定反应后进行温和的碱性水解,在高pH下将产物吸附到Nytran纸上,在pH 9条件下,通过液体闪烁计数测定纸上的放射性,并结合pHis的酸不稳定性使其能够只针对pHis进行检测。此外,Sun等[66]开发了一种碘化标记方法:由于咪唑基团上的氢被磷酸基团取代,因此无法用碘来标记pHis位点,而可以完全碘化未修饰的His,从而将两种组氨酸位点区分开。但由于以上这两种方法缺乏富集过程,因此N-磷酸化肽段受到非磷酸化肽段的严重干扰。此外,Wagner和Vu[67]通过薄层色谱从[γ-31P]ATP标记的pHis蛋白质的碱水解产物中用放射自显影检测到1-和3-pHis。有报道[68]使用邻苯二甲醛对氨基酸进行衍生化,并在pH 7.2的聚合物基反相柱(Hamilton PRP-1)上进行HPLC分离,使用14.3 mmol/L磷酸钠,1.1%(v/v)四氢呋喃,6.6%(v/v)乙腈的等度洗脱条件,可以完全区分1-pHis、3-pHis和pArg。

4 总结与展望

本文综述了N-磷酸化蛋白质/肽段富集和鉴定方法的研究进展。通过合成稳定的N-磷酸化氨基酸类似物,可以开发出了一系列针对pHis和pArg的抗体,并实现相应类型的N-磷酸化蛋白质/肽段的富集。然而,由于pLys结构更柔软,难以产生有效的免疫反应,因此针对pLys的抗体仍未见报道。此外,基于IMAC材料和色谱保留时间差异的方法能够实现pHis和pLys肽段的有效富集。在检测方法中,由于MS具有高通量和高准确度的特点,在N-磷酸化蛋白质/肽段的检测中显示出巨大潜力。

然而目前蛋白质N-磷酸化修饰的研究才刚刚起步,仍有很多问题亟须解决。首先,现有的富集方法难以实现中性条件下N-磷酸化蛋白质/肽段的富集,因此需要开发更温和高效的富集方法。第二,生物样本中存在相对高丰度的O-磷酸化蛋白质/肽段,会造成N-磷酸化蛋白质/肽段富集效率低、离子化效率低和位点定位不准确的问题,因此发展去除O-磷酸化蛋白质/肽段的方法是十分必要的。第三,在采用正离子模式MS情况下,常用的酸性流动相会造成N-磷酸化修饰一定程度的水解,因此亟须发展针对N-磷酸化肽段分离的流动相添加剂,或是发展高效的负离子模式。最后,由于N-磷酸基团容易在MS碎裂时发生中性丢失,因此还需发展适合于N-磷酸化修饰鉴定的MS采集方法。对于新发现的N-磷酸化蛋白质,其功能尚未揭示,因此需要推进相关生物学研究。