基于窄内径多孔层毛细管开管柱的纳流高效液相色谱用于N-衍生化氨基酸对映体的分离

李若男, 王利娟, 张东堂, 王亚楠, 郭广生, 汪夏燕

(环境安全与生物效应卓越中心, 绿色催化与分离北京市重点实验室, 北京工业大学化学化工系, 北京 100124)

多孔层开管(PLOT)毛细管柱是20世纪50年代末由Golay提出的一种重要的色谱微柱类型[1],目前已被广泛用于液相色谱分离。相比于毛细管填充柱和整体柱,PLOT柱具有更好的渗透性,且更易进行微型化[2]。随着其微型化的发展,PLOT柱已成为生命科学领域样品分析的重要工具。有研究报道[3,4],内径为10 μm的聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)PLOT柱已成功制备,并用于蛋白质组学分析。随后,Li等[5]将这种PLOT柱用于全血中稀有细胞的蛋白质组学分析。

目前,用于制备PLOT柱的方法主要有溶胶-凝胶法、原位热引发聚合法和原位光引发聚合法等[6-10]。其中,原位光引发聚合法常用于粗内径PLOT的制备,溶胶-凝胶法和原位热引发聚合法已被广泛用于内径为25 μm以下的NPLOT柱的制备,但是目前所报道的这些方法聚合时间均较长,聚合时间是影响PLOT柱形貌的重要因素之一[11]。

氨基酸是一类重要的手性分子,是构成蛋白质的基本单元,也是维持有机体生理机能的关键分子[12]。氨基酸的手性分离主要依赖于手性固定相。目前,多种奎尼丁类手性固定相已被用于N-衍生化氨基酸对映体、N-衍生化二肽立体异构体等的分离,具有较好的分离效率和手性选择性[13-17]。文献所报道的制备奎尼丁类手性固定相色谱柱所需要的时间大都为12 h[15-17],甚至更长[13,14],因而,需要进一步发展快速制备高性能的奎尼丁类手性固定相NPLOT柱的方法。

本研究以O-[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基氨基甲酰基]-10,11-二氢奎尼丁(MQD)为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂,甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)为共聚单体,环己醇和正十二烷醇为致孔剂,偶氮二异丁腈(AIBN)和2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(DMPA)为引发剂,采用原位热引发聚合法制备窄内径poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱,将聚合时间缩短至3 h。随后,将热聚合3 h制备的PLOT柱用于N-衍生化氨基酸对映体的分离,在2 min内即可实现对N-衍生化氨基酸对映体的快速分离。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Model 510色谱泵(美国Waters公司); Nova NanoSEM 430超高分辨率场发射电子显微镜(美国FEI公司); SAPPHIRE 800 CE毛细管紫外检测器(捷克Ecom公司); V2008数据采集卡(上海万象仪器有限公司); Barnstead Nanopure超纯水系统(美国Thermo Fisher Scientific公司); 6 μm i.d.(360 μm o. d.,聚酰亚胺外涂层)的熔融石英毛细管(美国Polymicro Technologies公司);孔径为0.22 μm的针头过滤器(上海德里安仪器有限公司);不锈钢密封瓶(北京工业大学校加工厂)。

HEMA、EDMA、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)和DMPA(百灵威科技有限公司);正十二烷醇(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司);甲醇和乙腈(色谱纯,Thermo Fisher Scientific公司);丙酮(北京化工厂);氢氧化钠、冰醋酸和AIBN(福晨(天津)化学试剂有限公司);环己醇(天津光复精细化工研究所);乙酸铵(国药集团化学试剂有限公司);O-9-[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基氨基甲酰基]-10,11-二氢奎尼丁(MQD)、间氯苯甲酰基-甲硫氨酸(m-ClB-DL-Met)、间氯苯甲酰基-丙氨酸(m-ClB-DL-Ala)、3,5-二甲氧基苯甲酰基-亮氨酸(3,5-DMB-DL-Leu)、3,5-二氯苯甲酰基-缬氨酸(3,5-DClB-DL-Val)、3,5-二氯苯甲酰基-色氨酸(3,5-DClB-DL-Trp)由暨南大学江正瑾教授课题组提供。实验前,采用孔径为0.22 μm的针头过滤器过滤使用的各种溶液。

1.2 Poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的制备

采用原位热引发制备窄内径poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱。首先,截取一定长度的6 μm i.d.毛细管,依次使用1.0 mol/L氢氧化钠溶液、超纯水、丙酮冲洗毛细管3、2、1 h,经氮气吹干。配制体积比为1∶1的γ-MAPS和丙酮的混合溶液,将混合溶液注入毛细管后封堵毛细管两端,在暗处反应24 h后使用丙酮冲洗毛细管,随后用氮气吹干毛细管备用。

其次,配制含有3.98% (质量分数,下同) MQD、7.98% EDMA、7.92% HEMA、40.00%正十二烷醇、39.77%环己醇、0.35% AIBN的热聚合溶液,经振荡、超声、除氧后注入上述内表面硅烷化后的6 μm i.d.毛细管,在显微镜下观察毛细管中聚合物溶液的液面,待液面到达距毛细管另一末端一定距离时,立刻停止注入溶液,封堵毛细管两端,将6 μm i.d.毛细管放入60 ℃水浴中反应。毛细管中未注入聚合溶液的部分在随后色谱实验中作为检测窗口使用。反应完成后用甲醇冲洗毛细管柱约8 h,即可制得窄内径poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱。

1.3 窄内径poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的表征

采用扫描电子显微镜(SEM)对NPLOT柱的横截面进行表征,观察其形貌及多孔层厚度。

1.4 纳流高效液相色谱-紫外检测系统

N-衍生化氨基酸对映体在自行搭建的纳流高效液相色谱-紫外(nano-HPLC-UV)检测系统中实现分离。基于NPLOT柱的nano-HPLC-UV系统由氮气瓶、溶液瓶、NPLOT柱、毛细管紫外检测器、数据采集卡和电脑等部分组成,见图1。

图 1 纳流高效液相色谱-紫外检测系统的示意图Fig. 1 Scheme of nano-HPLC-UV detection system PLOT: porous layer open tubular; DAQ: data acquisition.

图 2 热聚合不同时间制备得到的poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的SEM图Fig. 2 SEM images of poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT column prepared by in-situ thermal-initiated polymerization for different durations a. bare capillary; b. 3 h; c. 6 h; d. 9 h.

1.5 色谱条件

分别称取适量m-ClB-DL-Ala、m-ClB-DL-Met、3,5-DMB-DL-Leu,加入甲醇作为溶剂,振荡混合均匀,配制成1.0 g/L的样品溶液。分别称取适量3,5-DClB-DL-Val、3,5-DClB-DL-Trp,加入甲醇作为溶剂,振荡混合均匀,配制成10.0 g/L的样品溶液,于4 ℃下保存备用,其余低浓度的样品溶液均由高浓度的样品溶液稀释而成。采用自制的NPLOT柱为色谱柱,体积比为4∶1的乙腈-0.1 mol/L乙酸铵溶液(pH=5.3)为流动相,紫外检测波长为254 nm。

2 结果与讨论

2.1 窄内径poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的表征

聚合时间是影响PLOT柱中多孔层厚度的重要因素之一,聚合时间过长易导致PLOT柱的堵塞,尤其对于NPLOT柱[11]。因此,本研究采用原位热引发聚合法在6 μm i.d.的毛细管中制备poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱,考察了聚合时间对于多孔层厚度的影响,聚合时间分别为3、6和9 h制备得到的NPLOT柱的形貌见图2。图2a是裸毛细管的SEM图,通过测量可知标识为6 μm i.d.的毛细管的实际内径为6.76 μm。图2b、c、d分别是热聚合3、6和9 h制备得到的NPLOT柱的SEM图,随着热聚合时间的延长,多孔层的厚度逐渐增加,同时NPLOT柱由畅通变为堵塞。热聚合3 h和6 h制备得到的NPLOT柱的多孔层的厚度较为均匀,约为103±51 nm和210±51 nm,而热聚合9 h制备得到的NPLOT柱多出现堵塞。图3是热聚合3 h制备得到的NPLOT柱的多孔层的放大图,在聚合物层中分布有纳米孔。因此,当热聚合时间缩短至3 h时,便可以获得厚度均匀、形貌较好的NPLOT柱,热聚合时间的缩短能够有效缩短NPLOT柱的制备周期。

图 3 热聚合3 h的窄内径poly(MQD-co-HEMA-co- EDMA) PLOT柱的多孔层Fig. 3 SEM image of porous layer in poly(MQD-co- HEMA-co-EDMA) PLOT columns with narrow inner diameter by heating for 3 h

2.2 N-衍生化氨基酸对映体的分离

实验中考察了所制备的3种NPLOT柱对N-衍生化氨基酸对映体的分离性能,结果表明:热聚合9 h制备得到的NPLOT柱多出现堵塞,因此未对其进行分离表征;热聚合3 h和6 h的NPLOT柱都具有较好形貌,但是获得的多孔层厚度不同,导致分离柱的柱容量不同。不同性质和浓度的分析物所适用的分离柱不尽相同,对于N-衍生化氨基酸对映体的分离,聚合时间为6 h的NPLOT柱的分离时间大于6 min,而聚合时间为3 h的NPLOT柱仅在2 min内就实现了基本分离。针对快速分离而言,热聚合3 h的NPLOT柱已完全满足分离条件,因此文中仅对聚合3 h所制备的柱子进行了讨论。

图 4 N-衍生化氨基酸对映体的色谱图Fig. 4 Chromatograms of N-derivatized amino acid enantiomers Chromatographic column: poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT column, 6 μm i.d., total length 44.60 cm, effective length 40.70 cm; polymerization time: 3 h; sampling condition: 1.38 MPa, 20 s; sample concentration: 1.0 g/L; separation condition: 6.89 MPa; mobile phase flow rate: 32.24 nL/min.

图 5 N-衍生化氨基酸对映体混合物的色谱图Fig. 5 Chromatograms of N-derivatized amino acid enantiomers Sample: a. 10.0 g/L 3,5-DClB-DL-Val; b. 10.0 g/L 3,5-DClB-DL-Trp; c. complex of 5.0 g/L 3,5-DClB-DL-Trp and 5.0 g/L 3,5-DClB-DL-Val. Chromatographic column: poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT column, 6 μm i.d., total length 59.40 cm, effective length 54.20 cm; polymerization time: 3 h; sampling condition: 1.38 MPa, 20 s; separation condition: 1.38 MPa; mobile phase flow rate: 5.00 nL/min. 1. methanol; 2.3,5-DClB-L-Val; 3. 3,5-DClB-L-Trp; 4. 3,5-DClB-D-Val; 5. 3,5-DClB-D-Trp.

为表征窄内径poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的性能,本研究选用热聚合3 h制备的poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱对单对N-衍生化氨基酸对映体及两对N-衍生化氨基酸对映体的混合物进行了分离(见图4和图5)。

N-衍生化氨基酸对映体的分离度(R)、理论塔板数(N)、保留因子(k)、手性选择性(α)可根据以下公式进行计算:

(1)

其中,tR1和tR2分别是分析物的第1个色谱峰和第2个色谱峰的保留时间,W1/2(1)和W1/2(2)分别是第1个色谱峰和第2个色谱峰的半峰宽。

(2)

其中,tR是色谱峰的保留时间,W1/2是色谱峰的半峰宽。

(3)

其中,t0是溶剂峰的保留时间,tR是分析物色谱峰的保留时间。

(4)

其中,k1和k2分别是分析物的第1个和第2个色谱峰的保留因子。

2.2.1单对N-衍生化氨基酸对映体的分离

采用6 μm i.d. poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱对1.0 g/Lm-ClB-DL-Met、m-ClB-DL-Ala和3,5-DMB-DL-Leu进行手性分离,流动相的流速为32.24 nL/min,进样量仅为皮升级别。图4是m-ClB-DL-Met、m-ClB-DL-Ala和3,5-DMB-DL-Leu的色谱图。

根据文献[13]报道,采用以MQD为手性选择剂的色谱柱对N-衍生化氨基酸对映体进行分离时,L型氨基酸总是先于D型氨基酸被洗脱出来。如图4所示,第一个色谱峰是溶剂甲醇的色谱峰,第二个和第三个色谱峰分别是L型和D型氨基酸的色谱峰。在1.5 min内,m-ClB-DL-Ala和3,5-DMB-DL-Leu即可实现分离,分离度分别是1.52和1.25,而在2 min内3种N-衍生化氨基酸对映体均可在有效长度为40.70 cm的PLOT柱上实现分离,分离度、理论塔板数、保留因子和手性选择性见表1。

表 1 N-衍生化氨基酸对映体的分离度、理论塔板数、保留因子和手性选择性Table 1 Resolutions, plate numbers, retention factors, and enantioselectivity of N-derivatized amino acid enantiomers

2.2.2N-衍生化氨基酸对映体混合物的分离

为进一步表征窄内径poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的分离性能,采用该色谱柱对N-衍生化氨基酸对映体3,5-DClB-DL-Trp和3,5-DClB-DL-Val及其混合物进行分离,流动相流速为5.00 nL/min,进样量仅为皮升级别,分离结果见图5。通过与单对N-衍生化氨基酸对映体的色谱图的对比可知,1号色谱峰均为用作样品溶剂的甲醇的色谱峰,2～5号色谱峰依次属于3,5-DClB-L-Val、3,5-DClB-L-Trp、3,5-DClB-D-Val、3,5-DClB-D-Trp,其理论塔板数分别为1 890、1 717、4 899、4 527 plates/m,两峰之间的分离度依次为3.08、3.68、5.88。根据文献[13]报道,N-衍生化氨基酸对映体中的N-衍生基团和氨基酸侧链均可能与手性选择剂相互作用,有助于其手性识别。当衍生基团相同时,氨基酸侧链的大小和亲油性可能影响其在色谱柱上的保留顺序,同时N-衍生化氨基酸中带负电的羧基可能与MQD中带正电的叔氮之间存在静电相互作用[18]。而N-衍生基团中的苯环可能与MQD中喹啉环之间存在π-π相互作用。此外,N-衍生化氨基酸对映体中的氢可能与奎尼丁中的氧存在氢键相互作用。以上结果表明,热聚合3 h制备的poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱对单对N-衍生化氨基酸对映体及两对N-衍生化氨基酸对映体的混合物均可以达到较好的基线分离效果。

3 结论

本研究考察了不同热聚合时间下制备的窄内径poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA) PLOT柱的形貌和多孔层的厚度,热聚合时间为3 h和6h得到的NPLOT柱形貌较好、厚度均一。热聚合3 h的NPLOT柱对单对N-衍生化氨基酸对映体及两对N-衍生化氨基酸对映体混合物的分离效果较好。与粗内径的PLOT柱相比,NPLOT柱更有利于分析物与固定相间的相互作用,降低分离柱的涡流扩散效应和传质阻力,进而提高分离柱的柱效和分离能力。因此,NPLOT柱可以在更薄的多孔层厚度下实现较好的样品分离效果。NPLOT柱还具有制备周期短、消耗样品量低的特点,这将有助于NPLOT柱在生命科学研究中的进一步应用。

致谢 感谢暨南大学江正瑾教授课题组为我们提供MQD和N-衍生化氨基酸对映体样品。