纳米细菌在骨关节疾病中的研究进展

彭伟秋，张祥洪

(广西科技大学附属柳州市人民医院关节骨病科，广西 柳州 545006)

纳米细菌(nanobacteria NB)是时20世纪80年代Kajander等发现并命名以来，在生命科学领域引起了科学家们广泛的研究热情，是近30年来饱受关注和争议的研究课题[1]。研究者对NB的关注主要有三个方面：其一认为NB分布广泛，可感染任何生物组织和细胞，具有较大的毒性。NB可能是地球上最小的细胞形式，也可能是地球和地外细胞生命起源的细胞前体[2]。其二认为NB与人类病理性钙化类疾病和结石类疾病密切相关,生物体内的结石和病理钙化性组织内都可以检测出NB的存在，NB可能是引起这些疾病的病原体[3]。其三是动物实验中利用NB已经成功研制出胆囊结石和肾结石的动物模型，并用这些动物模型开始结石类疾病的形成机制和治疗方法探讨[4-5]。对NB争议的焦点是截然不同的两个方面：支持者认为NB是一种新型的微生物，属革兰阴性菌,呈球状或球杆状,体积极小，基因序列分析表明NB含16SrRNA序列[6]。Martel等反对者却认为NB不是一种新型的微生物，现有生物体的所必须的大分子蛋白和DNA的体积最小直径必须至少在200纳米以上，NB体积太小不可能容纳这些大分子物质，多聚酶链反应检测没有发现NB中有确定DNA或RNA[7-9]。

尽管关于NB是否是微生物的争议还在继续，但是NB与人类结石类疾病和病理性钙化类疾病的相关性探索研究一直是研究热点。骨是人体内主要钙化组织，近年来的一些研究发现表明，NB可能与人的骨质疏松症、骨性关节炎和类风湿关节炎等骨科疾病发生有关，NB与骨科疾病的一些相关性研究也引起大家的关注。本文拟从NB的特性以及NB在骨科疾病中的作用进行综述。

1 NB特性

1.1NB生物特性：Kajander等认为NB是一种新发现的古老生物，属革兰阴性菌,呈球状或球杆状,细胞壁厚,无荚膜与鞭毛结构[1]。NB体积极小,约50～500 nm,可通过直径<0.1 μm的细菌滤膜,高分辨率的原子显微镜可检测到NB菌体周围有羟基磷灰石碳酸盐结晶外壳。NB耐高温和强酸，普通的微生物培养和检测不适用于NB,必须用细胞培养方式和特殊检测方法。NB生长非常缓慢,每次分裂增殖周期约3～6 d。PCR基因序列分析认为NB与α2亚群的布鲁菌和巴尔通体菌属具有相似的16SrRNA序列。

Martel等认为NB虽然具有一些仿生物特性，但NB不是活的生物体，而是一种钙化的纳米颗粒(calcifying nanoparticles CNPs)[10]。Young等认为CNPs是生物体内钙稳态调节的生理性残留物和细胞培养的副产品[11-12]。CNPs主要由白蛋白、胎蛋白-A和载脂蛋白A1与钙和其他离子的结合形成有机矿物复合物。免疫印迹实验显示特定于NB的抗体与白蛋白、Fetuin-A都有反应；在含有血清的细胞培养基中加入析出的钙离子时可快速形成在形态学和化学上都与NB相同的矿化有机纳米颗粒CNPs。生理状态时，人体液内的Fetuin-A和少量白蛋白是纳米颗粒形成的抑制剂。病理条件下，Fetuin-A和白蛋白的抑制纳米颗粒形成由于各种原因减弱时，不但不能抑制纳米颗粒形成，还与钙或磷灰石结晶以某种方式结合，在体液中形成所谓的NB。这些CNPs可以在含血清的培养液中生长、增多，类似单细胞生物的生长，分裂和传代培养。

1.2NB的致病性：Hjelle等认为NB可感染任何生物体的组织细胞，具有细胞毒性[13]。人体感染NB后不能将NB彻底清除，普通的试验方法不能检测诊断，对细菌有效的常用抗生素对NB无效，临床上常用的化学消毒措施也不能杀灭NB。NB在感染的细胞内生长繁殖数目大于100个细菌时可引起细胞凋亡；NB的毒性分泌物为钙化的脂多糖,它可以杀死T-6淋巴细胞，也可刺激感染组织和细胞发生炎性反应因子反应,介导炎性反应因子形成和分泌增加，最终引起被感染细胞死亡和组织病理性钙化；NB周围形成的钙化生物膜,机体的免疫细胞不能识别,NB依靠自己钙化外壳的保护可以在生物体内长期存在。

Wong等认为NB不是致病微生物，而是钙化的有机纳米微粒CNPs，低浓度的CNPs在生理状态下没有毒性和致病性，高浓度的CNPs可以引起和加速细胞凋亡[14]。CNPs具有生物细胞生长、发育和传代繁殖的特性。生理状态下，CNPs参与骨骼和牙齿发育，是骨组织和牙组织的生理性钙化前体成份，CNPs还是肠道细菌和食物抗原的矿化免疫耐受机制形成的参与者。Shook等认为病理状态时，CNPs不但在异位钙化和肾结石中可以检测到，还在心血管疾病，慢性肾病和特发性早产儿也发现有CNPs参与相关[15]。NB的这一特性可为我们防治病理性钙化提供新方法。

1.3NB的分离、培养与检测：NB的分离常用滤膜滤菌法。该法取含NB标本溶液用0.22 μm滤膜反复过滤离心后取滤液培养。NB培养时需要使用胎牛血清,培养需在温度为37℃,含5%～10%CO2培养箱中进行。NB的检测有电镜下观察法，免疫荧光检测法和免疫抗体检测法。Smith 等认为PCR检测NB结果的准确性不高[16]。

Wu等通过对人和动物的血液、唾液、尿液和关节液等体液中发现NB存在[17]。Ansari等在人肾结石、胆囊结石和口腔结石等结石中检测到NB[18]。Richards等在心瓣膜、血管和胎盘等多种病理性的钙化组织中发现NB的存在[19]。

2 NB与骨科疾病

2.1NB与骨质疏松：Sommer等研究艾滋病患者骨密度(Bone Minal Density BMD)的减少和肾结石的形成趋势的相关性发现,NB可以导致BMD减少，其可能的原因是NB需要从血液中摄取钙和磷酸盐，影响人体内的钙和磷酸盐的稳态，进一步可能影响BMD而发生骨质疏松症[20]。

张名均等研究发现NB对人成骨细胞C3H10具有细胞毒性作用，主要机制是通过促进细胞凋亡发挥细胞毒作用。同时NB能促进钙化相关蛋白BMP-2的表达，也能引起凋亡相关蛋白Bax的表达升高，研究中羟基磷灰石对人成骨细胞C3H10无细胞毒性作用，羟基磷灰石虽然也能促进钙化相关蛋白BMP-2的表达，但不能促进凋亡相关蛋白Bax分泌[21]。研究证实NB具有羟基磷灰石完全不一样的特性。

郭亚楠等从钙化的胎盘中分离和培养出NB，认为NB可感染母亲的胎盘和胎儿[22]。NB感染胎盘可引起胎盘细胞结节和小叶纤维索性坏死，导致胎盘钙化。胎盘钙化和坏死可导致胎儿营养障碍和发育异常。NB感染胎儿可导致维生素D和钙磷离子代谢紊乱，认为NB可能与先天性佝偻病发病有关。

2.2NB与骨关节炎：骨关节炎是骨科常见的退行性疾病，发病的因素很多，具体机制不详。Tsuramoto等在膝骨关节炎的关节液中检测到NB，证实骨关节炎患者存在NB，作者推测NB与骨关节炎的发病可能有关[23]。彭伟秋等发现膝骨关节炎患者的关节液中NB检测阳性率100%，而正常膝关节的NB检测阳性率仅为4.5%，认为二者关系密切[24]。体外实验发现NB可以损伤软骨细胞，NB损伤软骨细胞时,没有氧自由基的参与，但有一氧化氮参与，一氧化氮介导的细胞损伤可能是软骨细胞坏死的机制。纳米细菌可能与骨关节炎的发病有关,但尚须进一步加以证实。

Tsurumoto等研制出一种生物传感器用来检测NB，发现骨关节炎患者的滑膜液中NB阳性检测率100%，证实NB在骨关节患者的关节液中普遍存在。但NB是否是骨关节炎的病因作者并没有进一步研究证实[25]。

Agarwal等运用NB仿生物特性制备携带白细胞介素受体拮抗剂的有机纳米微粒治疗骨关节炎研究中，发现这些新型的自组装纳米微粒在血清溶液中具有很好的细胞相容性和稳定性，可有效避免白细胞介素受体拮抗剂被人体在短时间内清除，局部高浓度的白细胞介素受体拮抗剂可增强抗炎强度和作用时间[26]。将携带白细胞介素受体拮抗剂的有机纳米微粒注射到骨关节炎患者关节腔内，关节间隙局部高浓度白细胞介素受体拮抗剂可阻止IL-1信号传导至细胞介导的炎性反应，从而控制和减轻骨关节炎病情，帮助软骨组织的再生和修复。

2.3NB与类风湿关节炎：石庆新等在探讨类风湿关节炎患者和正常人群血清标本中NB分布情况时，对正常人群和类风湿关节炎患者的血清进行NB培养，用钙染色技术对培养物进行NB检测，采用间接免疫荧光法进行纳米细菌鉴定。结果30例正常人血清NB的阳性检出率分别为6.7%，30例类风湿关节炎患者血清NB的阳性检出率为30.0%，提示类风湿关节炎的发病和NB感染可能有关[27]。

石庆新等用PCR技术对正常人群和类风湿关节炎患者关节液标本进行NB检测,发现类风湿关节炎患者关节液中存在NB,认为类风湿关节炎患者发病与NB感染关系密切。PCR法可以用于类风湿关节炎患者NB感染快速检[28]。

Tsuramoto等也报道在类风湿关节炎患者关节液中培养和检测时发现NB存在，推测NB可能与类风湿关节炎发病有关[25]。

陈琳等认为类风湿关节炎患者呈慢性发病。年龄越大,累及的中、大关节的越多;年纪越轻,关节滑膜血管增生越多、越明显[29]。NB与类风湿关节炎相关是不是受年龄有关需进一步研究证实。

2.4NB与骨的矿化：脊柱动物的骨和牙等矿化器官的形成机制仍是不解之谜。Olszt等在研究骨矿化形成时发现NB微粒存在，在骨形成早期,NB是大小不等的圆形矿化微粒，它们是散在依附在未骨化胶原纤维中的无定形矿化微粒，随着骨发育，这些NB无定形矿化微粒增多融合成片，形成纳米水晶矿物，增多的纳米水晶矿物再融合成片形成类似平板的纳米晶体，大量的纳米晶体充填满骨胶原纤维网时，骨的矿化就完成[30]。在骨形成过程中，NB的形成、增殖、融合、结晶和纳米水晶平板的形成发生异常，骨的矿化可能发生异常而发生骨病。NB可能是生理性骨矿化形成时的有机矿化前体，在NB的浓度异常或调节NB的因子异常时，才可能发生病理性钙化。

Bongio等用富含钙磷的NB微粒的胶原蛋白水凝胶为支架，将人脐内皮细胞植入培养检测支架的血管化变化，同时将骨髓间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞前体一起培养检测支架的成骨情形。研究发现脐内皮细胞在支架上可形成一个巨大的微血管网络，骨髓间充质干细胞分化附壁参与血管化。成骨细胞和破骨细胞前体的分化为成骨细胞和破骨细胞，二者分化速度受钙磷的NB微粒浓度的影响，也受联合培养的脐内皮细胞、骨髓间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞前体共同调节。四种细胞在富含钙磷的NB微粒的胶原蛋白水凝胶支架中成功的培育出血管化三维骨形成模型，为骨科疾病研究提供了新方法[31]。

2.5NB与异位骨化：疾病状态时，NB可参与异位骨化、结石类疾病和病理性钙化，NB与异位骨化相关的研究也引人关注。Orriss等认为焦磷酸盐可以抑制成骨细胞的异常骨化[32]。磷酸盐-焦磷酸比微环境是骨矿化的基本调节因子，它通过影响成骨细胞分泌NPP因子影响骨化。组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)参与焦磷酸盐分解，NPP和TNAP决定局部细胞外磷酸盐和焦磷酸盐水平。生理状态下，NB是骨组织的生理性钙化的前体成分。病理状态时，NB参与异位骨化的形成，焦磷酸盐作为影响生物矿化重要因子，有望成为抑制NB引起的异位骨化和病理性钙化。

Wu等认为Fetuin-A蛋白是调节生物矿化的重要子。在低浓度钙和磷酸盐液体中，Fetuin-A蛋白和白蛋白也可形成纳米样颗粒，这些颗粒进一步形成纺锤体、薄膜和聚合体复合物[33]。Fetuin-A蛋白作为矿化抑制剂比白蛋白强。矿物质-蛋白质浓度较高时，Fetuin-A作为引物引导白蛋白形成NB样复合物。在胎牛a蛋白的存在时形成的NB微粒更小，更倾向于多层环状的形态。Fetuin-A蛋白和白蛋白形成的NB样矿物颗粒在化学、光谱和形态学上与血清颗粒和NB相似。这些粒子可以从非晶态到晶体的转变，蛋白质与矿物质的比例低的微粒更有利于转化为晶体。Fetuin-A蛋白质和其他抑制因子的存在，阻碍磷灰石核的稳定形成，促使初生无定形细胞核或半晶球形纳米粒子逐渐长大，合并成晶体纺锤体和薄膜。这一特性为NB的异位骨化提供了新方法。

Pasch 等认为异位钙化患者血液中存在较高的异位钙化病理因素[34]。由于钙和磷酸盐结合钙化抑制蛋白Fetuin-A形成无定形含磷酸钙的蛋白颗粒(CPPs)，无定形CPPs可自发转化为含有结晶钙的次生CPP磷酸，通过血清CPP-Fetuin-A法测定可沉积Fetuin-A的数量和T50法测定无定形CPPs转变为结晶CPPs的时间可综合评估异位钙化风险，为改善全身性的钙化倾向提供依据。

3 展望

NB发现至今，经历了生物与非生物和致病菌与非致病菌的广泛争议与科学研究。最新的研究认为NB属非生物的钙化有机纳米颗粒，具有仿生特性，在形态、生长、增殖和传代培养特性上有着类似于细菌的生物生命形式。尽管围绕NB的争议还在继续，越来越多的研究表明，这样一个以纳米级存在,可以自我复制的矿化纳米颗粒具有极其大的潜在意义，它独特的生物矿化性质,为解释多种疾病的发生、发展提供新的依据,为我们治疗疾病提供新的方案,甚至为利用生物矿化提供了材料。对研究骨组织以外组织钙化性疾病、结石类疾病提供了纳米级视野，也为纳米生理学、纳米毒理学和纳米医学的未来研究提供了新思路。