番茄发酵液对α-淀粉酶活性的抑制作用

(贵阳学院食品与制药工程学院,贵州贵阳 550005)

随着生活水平的不断提高,糖尿病的发病率日益增加[1],引起糖尿病及各种并发症的原因主要是由于食源碳水化合物在α-淀粉酶和葡萄糖苷酶作用下较快的分解成葡萄糖和果糖,从而促进了血糖的快速增加[2-3]。其中,α-淀粉酶是调节血糖的关键之一,抑制该酶的活性能够有效阻碍或延缓碳水化合物分解的还原糖类物质在小肠被吸收和利用,从而避免餐后血糖的快速升高[4-6]。目前使用的抑制剂有人工合成和天然产物提取这两类,天然产物中获得的α-淀粉酶抑制剂主要在小肠中发挥着抑制作用,可减少合成类药物对人体肝脏的损伤[4]。目前,已有报道α-淀粉酶抑制剂可从微生物源和植物源黄酮、多糖中获得[5,7]。如鹰嘴豆、小麦、葛根及秋葵多糖、苦瓜和昆仑雪菊多糖对α-淀粉酶均具有一定的抑制作用[8-13]。也有报道果蔬汁经过发酵后黄酮类物质含量的增加,减缓了碳水化合物的分解速度从而达到控制血糖快速波动的作用[14-15]。番茄因含有番茄红素、黄酮、多酚等营养物质,具有良好的抗氧化性、抗衰老及降血糖等作用[16-17]。但就目前的报道来看,番茄经过自然发酵后对α-淀粉酶的抑制作用未见报道。

因发酵工艺相对天然产物活性物质提取工艺,具有制备便捷、成本低等优势,故本研究以具有降血糖作用的番茄为原料,采用自然发酵方式,通过体外模型研究发酵液对α-淀粉酶的抑制作用,旨在为番茄及其发酵产品的开发拓宽利用领域,也为预防高血糖功能性食品的研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番茄 果实饱满、色泽均匀、果蒂硬挺,购于沃尔玛超市;可溶性淀粉 分析纯,天津市永大化学试剂有限公司;氢氧化钠 分析纯,国药集团;酒石酸钾钠 分析纯,天津市登科化学试剂有限公司;结晶酚 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;3,5-二硝基水杨酸 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;无水硫酸钠 分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;无水乙醇 分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;磷酸二氢钾 分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;阿卡波糖标准品 99.80%,Sigma;α-淀粉酶 45.5 U/mg,合肥博美生物科技有限责任公司。

SHB-III循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂;AUW120D电子分析天平 日本岛津公司;TGL-16A高速台式离心机 湖南平凡科技有限公司;AS3120A超声波清洗器 上海浦鸿仪器厂;202-1AB型恒温干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;UV-2550紫外分光光度仪 日本岛津公司;PURIST超纯水系统 上海乐枫生物科技有限公司;SHA-B数显水浴恒温振荡器 常州澳华恩斯仪器有限公司;LDZX-30KBS高压灭菌锅 上海申安有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 番茄发酵液的制备 冲洗番茄表面黏附的杂物后,再用无菌水冲洗番茄表面并于无菌室晾干;白砂糖用紫外灯处理,按新鲜番茄与白砂糖(w/w)3∶1比例加入到已灭菌的玻璃瓶中,密封并放在暗处,室温发酵90 d,发酵初期定时排气并摇匀物料,分别在第0、10、20、30、60和90 d取样。将发酵样品破碎后10000 r/min离心10 min,稀释10倍后待测。

1.2.2α-淀粉酶抑制作用研究

1.2.2.1 发酵液稀释倍数对抑制α-淀粉酶的影响 参照上述α-淀粉酶抑制作用的测定方法1.2.3,取发酵30 d的样液,分别稀释5、7、9、11和13倍后与淀粉酶作用,再加入可溶性淀粉溶液反应5 min,最后加入1 mL DNS溶液终止反应,沸水浴5 min,分析不同番茄发酵液浓度对α-淀粉酶的抑制效果。

1.2.2.2 反应时间对抑制α-淀粉酶的影响 参照上述α-淀粉酶抑制作用的测定方法1.2.3,取发酵30 d的样液与淀粉酶分别作用5、10、15、20和25 min后,然后与可溶性淀粉溶液反应5 min,最后加入1 mL DNS溶液终止反应,沸水浴5 min,分析反应时间对α-淀粉酶的抑制效果。

1.2.2.3 反应温度对抑制α-淀粉酶的影响 参照上述α-淀粉酶抑制作用的测定方法1.2.3,取发酵30 d的样液与淀粉酶分别在25、29、33、37、41和45 ℃条件下作用5 min,然后与可溶性淀粉溶液反应5 min,最后加入1 mL DNS溶液终止反应,沸水浴5 min,分析不同反应温度对α-淀粉酶的抑制效果。

1.2.2.4 pH对番茄发酵液抑制α-淀粉酶的影响 参照上述α-淀粉酶抑制作用的测定方法1.2.3,取发酵30 d的样液与淀粉酶分别在pH为6.4、6.6、6.8、7.0、7.2的条件下作用,然后与可溶性淀粉溶液反应5 min,最后加入1 mL DNS溶液终止反应,沸水浴5 min,分析不同pH对α-淀粉酶的抑制效果。

1.2.2.5 番茄发酵液对α-淀粉酶抑制类型的研究 分别在0.1、0.3、0.5、0.7 U/mL淀粉酶作用下,按1.2.3的方法分析添加或不添加发酵液两种条件下的吸光度A,每种条件设三个平行,以酶浓度对反应速率作图,根据动力学图的特征分析番茄发酵液对α-淀粉酶抑制类型属于可逆或不可逆抑制类型[18-20]。

分别以0.3、0.5、0.7和0.9 mL 1%淀粉为底物,按1.2.3方法分析添加或不添加发酵液条件下的吸光度A,作Lineweaver-Burk双倒数图,确定番茄发酵液对α-淀粉酶抑制作用属于竞争性抑制或非竞争性抑制[18-20]。

1.2.3 番茄自然发酵对α-淀粉酶的抑制作用 参照3,5-二硝基水杨酸比色法[5,21],取6 U/mLα-淀粉酶和1 mL发酵样液混合摇匀,于37 ℃水浴预热5 min 后,加入0.8 mL 1%淀粉溶液反应5 min,最后加入1 mL DNS溶液终止反应,沸水浴5 min,取出冷却后,用超纯水定容至25 mL,以超纯水作空白调零,在540 nm下测定吸光值。其中,以0.6 mLα-淀粉酶加入0.8 mL 1%淀粉溶液和1 mL DNS作为空白;0.8 mL 1%淀粉溶液和1 mL DNS作为空白对照管;1 mL发酵样液加入0.8 mL 1%淀粉溶液和1 mL DNS为背景对照管。以5 mg/mL阿卡波糖溶液替代发酵液作为阳性对照,测定吸光值A,并计算其抑制率,计算式如下:

1.3 数据处理

用Excel 2010和SPSS 17.0进行分析,数据用平均值±标准差表示,以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与讨论

2.1 番茄自然发酵对α-淀粉酶抑制作用的影响

由图1可知,番茄自然发酵液具有抑制α-淀粉酶活性的作用。番茄发酵10 d时,发酵液对α-淀粉酶的抑制率迅速上升(P<0.05),20 d时其抑制率达到最大,但10～30 d内其抑制率变化差异不显著(P>0.05);且均高于紫菜和山药多糖[22],但低于5 mg/mL阿卡波糖阳性对照组(P<0.05)及桑葚渣提取物[23];说明番茄经过发酵后对α-淀粉酶的抑制作用增强。这可能在番茄发酵前30 d过程中,发酵液中的多酚、黄酮类活性物质显著增加,而这些物质具有较高的降糖活性[24];随着发酵时间逐渐延长,60 d时番茄发酵液对α-淀粉酶的抑制率显著下降(P<0.05),而与90 d时的抑制率差异不显著(P>0.05),但均高于未发酵的番茄(P<0.05),这可能是由于发酵时间增加,体系pH逐渐下降不利于微生物的生长或代谢产物的积累,抑制了降糖活性,导致α-淀粉酶抑制率降低;因此,就α-淀粉酶抑制作用效果,番茄自然发酵10～30 d较好。

图1 番茄自然发酵对α-淀粉酶的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of tomato fermented on alpha-amylase

2.2 α-淀粉酶抑制作用研究

2.2.1 发酵液稀释倍数对抑制α-淀粉酶的影响 图2所示α-淀粉酶的抑制率在番茄发酵液稀释倍数的范围内,随着浓度的降低其抑制率呈下降趋势(P<0.05),说明抑制率与稀释倍数具有线性关系,这可能是随着番茄发酵液稀释倍数的增大,其中多酚、番茄红素等活性物质的浓度下降从而使α-淀粉酶抑制率逐渐降低;这与槲皮素、山药多糖及紫菜多糖等物质对α-淀粉酶抑制率与抑制剂存在剂量依赖关系这一结果相近[18,22]。

图2 发酵液稀释倍数对抑制率的影响Fig.2 Effect of dilute concentration on inhibition rate

2.2.2 反应时间对抑制α-淀粉酶的影响 不同反应时间对发酵液抑制α-淀粉酶的影响如图3所示,随着作用时间的增加,其抑制率呈现先增加后减小的趋势。反应10 min时抑制率达到最高,此时番茄发酵液能有效阻碍淀粉酶与淀粉的结合;番茄发酵液对α-淀粉酶作用10 min后,其抑制活性随时间增加而下降(P>0.05),可能由于发酵液和酶的结合已趋于饱和[25],芳姜黄酮及其衍生物在不同反应时间下对α-淀粉酶活性抑制率也随时间的增加呈现先增加后减少的趋势,最佳反应时间为15 min[3]。而魏振奇等[26]得到的齐墩果酸对α-淀粉酶作用的最佳反应时间为25 min,且随时间的增加,抑制率逐渐上升,这与本实验得出结果不同,推测造成不同的原因可能是二者间存在不同的抑制剂,其抑制剂的作用方式有所不同,具体原因还有待进一步研究。本试验表明番茄发酵液与α-淀粉酶的结合作用较快,在反应时间10 min 时对α-淀粉酶的抑制率达到了最大。

图3 反应时间对抑制率的影响Fig.3 Effect of reaction time on inhibition rate

2.2.3 反应温度对抑制α-淀粉酶的影响 如图4所示,当反应温度在25～45 ℃范围时,番茄发酵液对α-淀粉酶的抑制率随温度的增加呈先增加后减小的趋势(P>0.05);番茄发酵液对α-淀粉酶的抑制作用在33 ℃时达到最大;随着反应温度的持续升高,对α-淀粉酶抑制率逐渐降低,这可能是由于温度的增加对酶的结构造成了一定的影响,从而限制了发酵液中的抑制剂组分与淀粉酶的结合[25];迟永楠等[27]研究发现反应温度低于60 ℃时对白芸豆抑制α-淀粉酶的活性没有太大影响;陈睿等[28]报道灰栒子提取物在0～90 ℃范围内对α-淀粉酶抑制作用无明显影响;总之,本试验在25～41 ℃的范围内番茄自然发酵液对α-淀粉酶活性抑制率的变化较小(P>0.05),由此推测番茄发酵液中抑制剂在试验温度范围内具有较好的热耐受性,其稳定性较好。

图4 反应温度对抑制率的影响Fig.4 Effect of temperature on inhibition rate

2.2.4 pH对番茄发酵液抑制α-淀粉酶的影响 由图5所示,番茄发酵液对α-淀粉酶的抑制作用条件偏中性,在pH6.4～6.8范围内,其抑制率随着pH的增加逐渐升高;在pH6.8 时番茄发酵液对α-淀粉酶的抑制作用达到最大(P<0.05);当pH大于7.0后,随着pH升高其抑制率显著下降(P<0.05),可能由于碱性条件使淀粉酶的活性中心和发酵液抑制剂结构发生解离或改变[25],从而阻碍了抑制剂对α-淀粉酶的抑制作用。本实验结果与乙醇浸提的水翁花对α-淀粉酶活性抑制[29]的结果相似。

图5 pH对抑制率的影响Fig.5 Effect of pH on inhibition rate

图6 发酵液对α-淀粉酶的抑制动力学曲线Fig.6 Inhibition kinetics curves of fermentation broth on α-amylase

2.2.5 番茄发酵液对α-淀粉酶的抑制类型 如图6所示,在酶浓度与反应速率相互关系中,发酵液抑制剂组的直线斜率低于无抑制剂组的直线斜率,且两条直线均通过了原点,故可推断番茄发酵液对α-淀粉酶的抑制类型属于可逆抑制。

按照动力学方法区分番茄发酵液对α-淀粉酶的可逆性抑制作用,在米氏方程的双倒数图(图7)中看出,发酵液组相比无抑制剂组的反应速度减小,添加或不添加番茄发酵液的两条直线回归方程的延长线均相交于横坐标轴,表明番茄发酵液的加入并没有改变酶对底物的亲和力,发酵液与底物可同时与酶的不同部位结合,并在底物存在下发酵液才能发挥其抑制作用[21,30],故发酵液对α-淀粉酶活性的抑制作用属于非竞争性抑制。这与甜叶菊毛状根绿原酸类化合物[5]及黑果腺肋花楸多酚[6]对α-淀粉酶活性的抑制作用相似,不同于高粱原花青素[21]和山药多糖[25]对α-淀粉酶活性的抑制作用,它们则属于竞争性抑制。再根据图中两直线与横坐标轴交点和直线回归方程推算,两直线相交的横坐标即番茄发酵液对α-淀粉酶催化活性抑制常数为4.01 mg/mL。

图7 抑制作用的双倒数图Fig.7 Double reciprocal plot of inhibition effect

3 结论

番茄经过自然发酵后能够显著提高对α-淀粉酶的抑制作用,尤其在发酵10～30 d时其抑制能力较强;其次,发酵液抑制α-淀粉酶的最优作用条件为:抑制剂与淀粉酶在33 ℃、pH6.8下作用10 min,这表明番茄发酵液对α-淀粉酶的抑制作用温和且亲和力较强;并且番茄发酵液对α-淀粉酶的抑制属于非竞争可逆型,其抑制常数为4.01 mg/mL。这表明番茄发酵液可作为保健产品开发的原料,同时为α-淀粉酶抑制剂的开发和利用提供了新途径,但发酵液中组分较复杂,对α-淀粉酶起抑制作用的具体物质结构和作用机理还有待于进一步解析。