三唑类农药及其金属配合物对病原真菌抑制效果研究

方利敏，汪流伟，熊 丹，聂旭亮，戴金岳，姚明印，黄 林*

三唑类农药及其金属配合物对病原真菌抑制效果研究

方利敏1，汪流伟1，熊 丹1，聂旭亮2，戴金岳1，姚明印3，黄 林1*

（1. 江西农业大学 生物科学与工程学院/江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室/应用微生物研究所，江西 南昌 330045；2. 江西农业大学 理学院，江西 南昌 330045；3. 江西农业大学 工学院，江西 南昌 330045）

为评价三唑类农药及其金属配合物对病原菌的抑制效果。试验采用滤纸片法测定3种三唑类农药及其金属配合物对6种病原真菌、2种细菌以及2种酵母菌抑制作用，选取抑菌谱较广且效果较好的药剂，经菌丝生长速率法和牛津杯法进一步测定其对松球壳孢菌、西瓜枯萎病菌、黑曲霉、桔青霉和意大利青霉等病原真菌的抑菌效果。结果表明，烯唑醇Co（Ⅱ）配合物抑菌广谱性更强，其对上述真菌、细菌及酵母菌均具有抑制作用，尤其对病原真菌的抑制效果最好，当浓度为2.50 mg/mL时，对松球壳孢菌的抑制率达到95.81%，此时意大利青霉的抑菌圈直径达到了31.77 mm。而烯唑醇Ag配合物的针对性更强，其对松球壳孢菌和意大利青霉菌的抑制作用最强，当浓度为0.50 mg/mL时，能完全抑制松球壳孢菌菌丝的生长，此时意大利青霉的抑菌圈直径为25.07 mm，抑制效果明显强于黑曲霉和桔青霉。可见烯唑醇Co（Ⅱ）和烯唑醇Ag配合物对病原真菌均有较好的抑菌效果，具有较高的应用潜力。

三唑类农药；金属配合物；广谱性；抑菌活性

三唑类农药即为三个氮的三唑化合物，20世纪70年代，该农药迅速发展，到90年代已占杀菌剂农药的10%[1]。三唑类农药具有内吸性且对麦角甾醇的合成有一定的抑制作用，但由于长期使用，以及作用机制和作用位点单一性等原因，导致大多数病原类微生物对其产生抗药性[2-5]。Sykora等[6]在Dvoran上接种了来自不同地方的白粉菌，分别检测其对三唑醇和粉唑醇的敏感性，结果表明供试大麦白粉菌对三唑醇和粉唑醇产生了抗药性。因而在确保对有害微生物有效防治的基础上，降低有害微生物抗药性的研究引起了广大学者的关注。金属元素因具有耐高温、抑菌性强、能促进植物生长且消除顶端优势等特点[7-9]，被用于与三唑类农药相络合，以形成对微生物具有高效、低毒、低残留、广谱杀菌作用且持效的金属配合物农药，进而弥补配体农药的不足。Zhang等[10]对合成的氟康唑新型金属配合物及原药氟康唑进行抑菌活性判定发现，金属配合物能在极低浓度下抑制菌体生长，且抑菌活性远高于氟康唑原药。Li等[11]以多效唑和烯效唑为原料，合成了两个Cu（Ⅱ）金属配合物，研究发现该配合物抑菌活性较其他配体高1.20~5.94倍。杨春龙等[12]合成的丙环唑金属配合物对病原菌的抑菌效果优于配体丙环唑，同时具有较好的缓释性能。

可见三唑类农药及其金属配合物对病原菌均具有良好的抑制作用。本试验利用课题组前期自行合成的3种三唑类农药及其金属配合物药剂，进一步研究其对不同病原真菌、细菌和酵母菌的广谱性抑制作用，并测定烯唑醇Co(II)和烯唑醇Ag配合物对松球壳孢菌、西瓜枯萎病菌、黑曲霉、桔青霉和意大利青霉等多种病原真菌的防治效果。为寻找高效、低毒、广谱的三唑类衍生物农药提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 指示菌

2种细菌：G-：大肠杆菌（）、G+：金黄色葡萄球菌（）；2种酵母菌：酿酒酵母（）、面包酵母（）；6种常见病原真菌：意大利青霉（）、桔青霉（）、黑曲霉（）、松球壳孢菌（）、西瓜枯萎病菌（）、莴苣霜霉病菌（）均为江西农业大学微生物资源与利用实验室自行保存。

1.2 培养基[13]

牛肉膏蛋白胨固体培养基、马铃薯（PDA）培养基。

1.3 三唑类农药及其金属配合物

由课题组自行合成，种类如表1。

1.4 药剂配置

1.4.1 2.50 mg/mL三唑类农药及其金属配合物溶液的配制 课题组前期研究表明，浓度为2.50 mg/mL烯唑醇及其金属配合物对意大利青霉（ACCC 30399）、指状青霉（ACCC 30399）、水稻纹枯病菌（）和灰霉菌（）等均具有较好的抑菌作用，因此，试验选取该浓度进一步测定三唑类农药及其金属配合物对微生物的抑菌效果[14]。分别准确称取0.025 g上述杀菌剂于24根试管中，加入10 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，4 ℃保藏备用。

1.4.2 不同浓度烯唑醇Co(II)和烯唑醇Ag配合物的配制 采用二倍稀释法，将烯唑醇Co(II)和烯唑醇Ag配合物分别溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，配制成不同终浓度的药液。

表1 三唑类农药及其金属配合物种类

1.5 实验方法

1.5.1 三唑类农药及其金属配合物对微生物的抑菌效果 试验采用滤纸片法[15]测定三唑类农药及其金属配合物对多种微生物的抑菌效果。将滤纸片分别浸泡于配置的药液中1 h，取出沥干，分别贴于含有细菌、霉菌和酵母菌的平板中，以添加N,N-二甲基甲酰胺为对照组，置于37 ℃和28 ℃恒温培养箱中分别培养24 h和72 h，十字交叉法测定抑菌圈直径并记录，每个处理重复3次。

1.5.2 烯唑醇Co(II)和烯唑醇Ag配合物对松球壳孢菌、西瓜枯萎病菌菌丝生长的影响 按照菌丝生长速率法[16]将供试菌块（=8.0 mm）置于不同含药PDA平板上培养，以添加N,N-二甲基甲酰胺为对照组，待对照组平板上的菌丝布满2/3时，测定菌丝生长直径并计算菌丝总生长量（菌丝总生长量=菌丝生长直径－菌丝块直径）和菌丝生长抑制率，根据生物统计几率值换算表，以几率值作因变量，浓度的对数为自变量构建毒力回归方程，利用方程和几率值分别得出50和90。

1.5.3 烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物对黑曲霉、桔青霉和意大利青霉生长的影响 采用牛津杯抑菌圈法[17]将配制好的烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物分别加入含有黑曲霉、桔青霉和意大利青霉的PDA平板中，以添加N,N-二甲基甲酰胺为对照，置于28 ℃培养箱，待对照菌丝长满整个平板时，采用十字交叉法测定抑菌圈直径，每个处理重复5次。

1.5.4 数据分析 采用Excel 2010和Origin 9.0分别进行数据处理和绘图分析。

2 结果与分析

2.1 三唑类农药及其金属配合物对微生物的抑菌效果测定

试验将不同三唑类农药及其金属配合物用N,N-二甲基甲酰胺充分溶解制成2.50 mg/mL的药液，采用滤纸片法对多种微生物进行抑菌效果测定。结果如表2所示，烯效唑、多效唑及其金属配合物对上述试验微生物抑制效果均较差，而烯唑醇及其金属配合物对上述微生物均有一定抑制效果，尤其烯唑醇Co(II)和烯唑醇Ag配合物抑制的微生物种类（西瓜枯萎病菌、桔青霉、松球壳孢菌、莴苣霜霉病、黑曲霉、意大利青霉、面包酵母和酿酒酵母）较多，且对6种病原真菌均有较为明显的抑菌效果，对比烯唑醇配体与其金属配合物的抑菌效果发现，烯唑醇金属配合物的抑菌效果比配体化合物的更明显。

2.2 烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物对松球壳孢菌、西瓜枯萎病菌菌丝生长影响测定

表3、表4结果表明，烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物对松球壳孢菌、西瓜枯萎病菌菌丝均具有抑制作用，其中这两种药剂对松球壳孢菌抑制作用更强，当烯唑醇Co (II)配合物浓度为2.50 mg/mL时其抑制率达95.81%，菌丝生长抑制的50和90分别为0.03 mg/mL 和0.66 mg/mL。而烯唑醇Ag配合物在浓度为0.50 mg/mL时能完全抑制松球壳孢菌的菌丝生长，其50和90分别为0.03 mg/mL和0.12 mg/mL。可见，烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物在低浓度下对松球壳孢菌具有较强的抑菌活性。而这两种药剂对西瓜枯萎病菌的抑菌效果较差，当浓度为10.00 mg/mL时，烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物对西瓜枯萎病菌的抑制率才达到86.39%和86.70%，其菌丝生长抑制的50分别为0.36 mg/mL和0.84 mg/mL，抑菌所需的浓度较高。可见，烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物对两种菌的抑菌效果有所差异，可能源于药剂对不同菌种的特异性。

表2 三唑类农药及其金属配合物对不同微生物的抑制作用

抑菌圈直径分别为（+）：12 mm以下；（++）：12~20 mm；（+++）：20~30 mm；（++++）30 mm以上

表3 烯唑醇Co (II)配合物对松球壳孢菌与西瓜枯萎病菌菌丝生长的影响

表4 烯唑醇Ag配合物对松球壳孢菌与西瓜枯萎病菌菌丝生长的影响

2.3 烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物对黑曲霉、桔青霉和意大利青霉生长影响测定

图1、图2结果表明，烯唑醇Co(II)和烯唑醇Ag配合物对黑曲霉、桔青霉和意大利青霉三种霉菌均具有一定抑制作用，其中烯唑醇Co(II)配合物对意大利青霉抑制效果比黑曲霉和桔青霉更为明显。尽管如此，在其浓度为2.50 mg/mL时对黑曲霉和桔青霉的抑菌圈直径能分别达到18.45 mm和14.21 mm，当烯唑醇Co (II)以浓度0.10 g/mL对意大利青霉作用时，其抑菌圈直径为16.13 mm，而将浓度调整为2.50 mg/mL时抑菌圈直径更是高达31.77 mm（图2a）。可见，抑菌圈直径随烯唑醇Co (II)配合物浓度的增加而增大，抑菌效果也随之变得更为明显，且微生物的种类对烯唑醇Co (II)配合物的抑菌效果也有一定的影响。而烯唑醇Ag配合物则对桔青霉抑制作用较弱，在浓度为2.50 mg/mL时其抑菌圈直径仅为9.16 mm，对黑曲霉抑制作用较好，此时的抑菌圈直径可达18.16 mm。同时对意大利青霉抑制作用最强，这与烯唑醇Co (II)配合物对其抑制效果相似，在浓度为0.10 mg/mL时其抑菌圈直径可达16.05 mm，待浓度调整为2.50 mg/mL时抑菌圈直径则达到了27.60 mm（图2b）。

图中由上而下分别为黑曲霉、意大利青霉、桔青霉，烯唑醇Ag配合物浓度从左到右分别为0，0.10，0.125，0.25，0.50，1.25，2.50 mg/mL

图2 不同浓度烯唑醇Co (II)配合物（a）和烯唑醇Ag配合物（b）对三种霉菌的抑制效果

3 讨论与结论

三唑类农药中的氮原子能与血红素中的铁离子经配位键结合，降低氧结合率，使得14α—去甲基化酶的活性下降，抑制麦角甾醇的合成，进而影响微生物细胞膜的形成，起到杀菌作用[18]。但一旦使用过度，则会使病原菌对杀菌剂农药敏感，产生耐药性，无法很好的杀灭病原菌。同时其在环境土壤中，由于残留量大、降解性能低，给环境也带来了较大负担。基于此，三唑类农药急需转型，以降低对环境的危害。

三唑类金属配合物在抑菌过程中具有广谱、低毒且高效等特性，使其在一定程度上能够缓解目前面临的农药和环境危机问题[19-20]。金属配合物较三唑类配体杀菌剂的抑菌效果更好，这可能是由于金属元素本身具有抑菌效果，而其抑菌作用的增强则是与三唑类农药协同作用的结果[18,20-21]。李洁[23]合成的烯唑醇金属配合物对四种病原真菌的抑制作用均优于配体化合物；胡春燕等[24]在抑菌试验中发现金属配合物的抑菌活性均高于配体烯唑醇，且抑菌活性随浓度的增加也有不同程度的增强。大量研究表明农药杀菌剂对细菌的抑菌效果仍低于病原真菌，这就使得多数三唑类农药被用于病原真菌的防治。本试验通过多类三唑类农药及其金属配合物的抑菌实验可见：烯唑醇类的抑菌效果在多种农药杀菌剂中相对更好，而这种抑菌效果在其金属配合物作用下显得更加明显，尤其是烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag两种配合物，不仅抑菌效果好，而且还具有抑菌谱广的特点，尤其对病原真菌的抑菌作用更强。王晓锦[25]合成的所有三唑类化合物及其金属配合物对真菌均有抑制作用，且抑制率能够达到88%左右，而其中只有一部分农药对细菌起抑制效果，这与试验中烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物对病原真菌的抑制作用强于细菌的结论类似。

同时为探讨两种农药对病原真菌的抑制效果，试验进一步研究了不同浓度的烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物对5种病原真菌的影响，可以发现烯唑醇Co (II)和烯唑醇Ag配合物对松球壳孢菌和意大利青霉生长均具有较好的抑制作用，烯唑醇Co (II)配合物在浓度为2.50 mg/mL时，松球壳孢菌的菌丝生长抑制率达95.81%，此时意大利青霉的抑菌圈直径高达31.77 mm，这与熊辉[26]所合成的烯唑醇Co (II)配合物在多种微生物中对意大利青霉的抑菌效果最好的结论类似。而烯唑醇Ag配合物的针对性更强，当浓度为0.50 mg/mL时能够完全抑制松球壳孢菌的生长，同时对意大利青霉的抑菌效果虽不及烯唑醇Co (II)配合物，但其抑菌圈直径也达到了27.60 mm。综上，三唑类金属配合物的抑菌效果明显强于三唑类配体，且抑菌效果随配合物浓度增加而逐渐增强，与此同时微生物种类也造成了同种配合物抑菌效果的差异性。这为进一步制备新型三唑类农药及其金属配合物提供理论依据。

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Study on Antibacterial Effect of Triazole Fungicides and Their Metal Complexes on Pathogenic Fungi

FANG Li-min1, WANG Liu-wei1, XIONG Dan1, NIE Xu-liang2, DAI Jin-yue1,YAO Ming-yin3, HUANG Lin1*

(1. Jiangxi Engineering Laboratory for the Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources/ Institute of Applied Microbiology/College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. College of Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 3. College of Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

To evaluate the inhibitory effect of triazole fungicides and their metal complexes on micro-organisms, experiments with the filter paper method were carried out to determine the inhibitory effects of 3 triazole fungicides and their metal complexes on six pathogenic fungi, two kinds of bacteria and two kinds of yeasts. The fungicides with wide antimicrobial spectrum and good inhibitory effects were selected to determine the inhibiting effects on pathogenic fungi such as,,,andthrough the mycelial growth rate method and the Oxford cup method. The results showed that the Co(diniconazole)2Cl2was with more broad-spectrum, and had antibacterial activity against the above fungi, bacteria and yeasts, especially against the pathogenic fungi; when the concentration was 2.50 mg/mL, the inhibition rate againstreached 95.81%, and at this time, the mycostatic zone ofreached 31.77 mm in diameter. The Ag(diniconazole)2Cl2was more targeted, and had the strongest inhibitory effect onand; it could completely inhibit the mycelium growth ofwhen the concentration was 0.50 mg/mL, and at this time, the mycostatic zone ofreached 25.07 mm in diameter, and the inhibitory effect was significantly stronger than that ofand. So, the Co(diniconazole)2Cl2and Ag(diniconazole)2Cl2had good antibacterial effects on pathogenic fungi with high application potentials.

triazole fungicides; metal complexes; broad spectrum; anti-bacterial activity

O627.23

A

2095-3704（2020）01-0019-07

2019-12-11

国家自然科学基金项目(31560482) 、江西省教育厅科技项目（GJJ160382）和江西农业大学大学生创新创业计划项目(201710410036)

方利敏（1995—），女，硕士生，主要从事微生物源保鲜剂开发和利用研究，1481562615@qq.com；*通信作者：黄林，副教授，博士，huanglin213@126.com。

方利敏, 汪流伟, 熊丹, 等. 三唑类农药及其金属配合物对病原真菌抑制效果研究[J]. 生物灾害科学, 2020, 43(1): 19-25.

10.3969/j.issn.2095-3704.2020.01.04