拉萨地区青稞种植土壤中细菌多样性高通量分析

刘青海, 潘 虎, 达娃卓玛, 田 云, 刘虎虎, 王 翀, 卢向阳, 白军平

(1. 西藏自治区农牧科学院 农业质量标准与检测研究所， 拉萨 850032； 2. 湖南农业大学 生物科学技术学院， 长沙 410128)

土壤微生物群落结构和组成多样性有助于维持土壤生态系统的稳定与协调，同时能提高缓冲能力，防止土壤微生态环境的恶化[1]。土壤微生物群落的动态平衡是确保土壤健康的重要标准，有健康良好的土壤环境才能保证植物的健康生长[2-5]。青藏高原是地球上最高的高原板块，是最早的高原，面积约为253×104km2，占中国领土面积的26%，它也是地球陆地生态系统中的重要一部分，它的平均海拔高度在4000 m以上，具有高寒、缺氧、降水少、日照长、辐射强等特点，其独特的自然环境为微生物的生长提供了独特条件[6-10]。植物、土壤和微生物的相互作用构成植物、土壤和微生物的有机整体，土壤微生物在各个方面影响植物的生长和发育，土壤微生物降解有机物质，合成次生代谢物，调节营养供应，并影响植物生长、资源分配和多样性[11-13]，因此，土壤微生物多样性在植物生长发育和群落结构演替中起着重要作用。本研究以高原特色农作物青稞为研究对象，以青稞种植土壤为试验材料，通过Illumina高通量测序技术[14]分析青稞种植土壤中细菌的群落结构及多样性，该研究不仅可增强对拉萨地区青稞农田土壤细菌多样性的认识，为拉萨乃至青藏高原不同生境中细菌多样性或资源的保护奠定基础，而且为进一步研究我国高寒地区微生物生态系统和开发利用有益的微生物资源提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验样品采集

根据西藏青稞生育期选择3月25日(播种前期)、7月8日(灌浆期)、9月28日(收获后期)在拉萨河谷地区选择9块大面积青稞种植农田采集土壤样品。土壤样品采集采用五点取样法，样品混匀后用无菌塑封袋封装，-18 ℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤样品基因组DNA的提取

采用TIANGEN公司土壤基因组DNA提取试剂盒(DP336)提取青稞种植农田土壤样品中细菌的总DNA，具体步骤按说明书操作。所提取的总DNA于-20 ℃保藏备用。

表1 拉萨地区土壤样品采集信息

1.2.2 细菌16S rDNA-V3区的PCR扩增及测序

用提取的总DNA为模板，采用细菌V3区通用引物 338F/518R(表2)扩增目的片段，PCR扩增体系(50 μL)如下：10×Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，引物各1 μL，TakaRaTaq(5 U/μL) 0.25 μL，模板1 μL，无菌水37.75 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。取2 μL PCR产物，2 %琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增产物送至杭州晶佰生物科技有限公司进行测序，测序平台为Illumina Miseq。

表2 扩增所用PCR引物

1.2.3 生物信息学分析

采用CASAVA(v1.8.2)软件对原始测序结果图像进行图像碱基识别，原始数据经过预处理去除低质量的序列后应用Pandaseq(v2.7)和Trimmomatic(v0.33)软件进行数据优化分析，获得高质量序列数据。计算在 97%的相似水平上每个样本的操作分类单元(OTU)数量，并绘制稀疏曲线。利用Qiime(v1.9)软件计算样品包括Chaol指数和Shannon指数的α多样性值，其Chaol指数值越高，表明群落物种的丰富度越高，Shannon指数值越高，表明群落物种的多样性越高。

2 结果与分析

2.1 拉萨河谷地区土壤细菌多样性分析

图1 9个样品的稀释曲线

由图1可知，所有土壤样品的稀释曲线最终均趋于平缓，说明此次测序深度全面地覆盖了土壤绝大多数的细菌信息，数据能够较好地反映土壤样品中细菌群落区系组成；各个样品及组的Chao丰度估计量、Shannon指数、测序深度指数、有效序列数及OUT数量见表3，所有样品的测序深度指数均在0.85以上，表明随着测序数量的增加发现新的细菌种类的概率较小；其中，Group 2组(7月8日、灌浆期)各样品的Chao指数均低于Group 1组(3月25日、播种前期)和Group 3组(9月28日、收获后期)，说明该阶段的土壤细菌群落丰富度与其他两个时期存在差异性变化；各样品的Shannon指数均值大小为Group 1(3月25日、播种前期)

表3各个样品的细菌群落多样性

2.2 OTU分析和物种注释

对OTUs的代表序列进行物种注释后，各个样品中在属(Genus)水平上丰度排名前15的物种见图2，其中酸杆菌门(Acidobacteria)的Gp6、Gp4、Gp7和Gp16，芽单胞菌门(Gemmatimonas)的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和芽生球菌属(Blastococcus)，放线菌门的Gaiella、节细菌属(Arthrobacter)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)等成为该区域细菌中的优势种群。

图2 属水平上前15名细菌的相对丰度

2.3 组内多样品的物种差异性分析

对各组样品的细菌群落进行了主成分分析PCoA(principal coordinates analysis)。结果表明，各组的样品间群落组成差异性不相同，且各组所表现的差异点也不一致(图3)。

在Group 1中，2-1样品和8-1样品之间距离较近，说明微生物群落组成差异并不明显，9-1样品和6-1样品与其他样品之间距离较远，说明这两个样品与组内其他样品的群落组成差异最大；进一步通过属水平的Top15群落比较发现：9-1和6-1样品中细菌群落分别缺少Spartobacteria_genera_incertae_sedis和Ilumatobacter，同时含有的Ohtaekwangia是同组其他样品中所没有的，而6-1中独有的节细菌属(Arthrobacter)也是引起群落组成差异显著的重要原因。

在Group 2中，各样品的群落组成相对均衡，而1-2、7-2和9-2的群落组成最相近，通过PCoA分析难以区分；在Group 3中，7-3、8-3和9-3的群落组成相近，通过PCoA分析难以区分；而3-3与4-3分别与组内其他样品的群落组成差异最大。进一步通过属水平的Top15群落比较发现：3-3和4-3样品中细菌群落分别含有的Opitutus和假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)是其他样品中所缺少的，这可能是引起群落组成差异显著的重要表现。

图3 各组样品的主成分(PCoA)分析

2.4 组间多样品的物种差异性分析

根据Group 1中属层次上Top15群落序列数的统计信息，分析了Group 1中各样品与Group 2、Group 3中对应点样品的差异物种，结果(表4)显示，2号、3号、4号和8号样品在不同时期群落组成相比，在Gp16、Gaiella、Ilumatobacter和Nocardioides数量上存在显著差异。其中2-1号与2-2、2-3组成相比具有较多的Gp16(P<0.05)；8-1号与8-2、8-3组成相比具有较多的Gp16和Gaiella(P<0.05)；3-1号与3-2、3-3组成相比具有较少的Nocardioides和Ilumatobacter(P<0.05)；4-1号与4-2、4-3组成相比具有较少的Gaiella和Ilumatobacter(P<0.05)。

采用LSD多重比较，对不同时期的同一采样点组间进行两两比较，结果(表5)显示9个采样点中除了7号样点的群落组成未见显著差异细菌，1号、2号、3号和8号组成具有1个显著差异属种；4号组成具有2个显著差异属种，而5号、6号和9号组成达到了3个显著差异属种。

表4 不同时期同一地点属水平上前15名细菌的比较

表5 属水平上组间各样品差异物种

3 讨论与结论

放线菌门和酸杆菌门是高寒地区土壤细菌群落的主要门[15-18]，如青藏高原草原[19]、青藏高原的Chaka湖和Athalassohaline湖[20]和其他20个湖泊[21]。本文首次采用Illumina高通量测序技术对青藏高原拉萨河谷地区9处不同青稞种植农田土壤进行了细菌群落结构解析，研究发现农田土壤中细菌的优势种群为酸杆菌门(Acidobacteria)的Gp6、Gp4、Gp7及Gp16，芽单胞菌门(Gemmatimonas)的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和芽生球菌属(Blastococcus)，放线菌门的Gaiella、节细菌属(Arthrobacter)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)，这与刘敏等[22]发现类似。西藏不同海拔高度的常见优势细菌群落是放线菌门、变形菌门和酸杆菌门，这也与大部分土壤中优势细菌群落特征类似[23]。Manoj等[24]使用高通量测序技术研究了北极圈土壤微生物多样性，结果表明北极圈高寒地区土壤细菌与其他地区土壤细菌组成没有本质差别。本研究间接证明了这一观点，青藏高原农田土壤细菌种群与其他地区土壤细菌种群也无本质差别。

农田土壤微生物群落结构已有很多研究。刘振东等[25]利用高通量测序技术，对西藏主栽品种青稞根系和根系内生细菌群落结构进行了分析，研究发现青稞根际内生细菌主要是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)，这与本实验结果类似。罗建峰与曲东[26]研究发现西藏高原4个土样的细菌主要体现在厚壁菌门和变形菌门中， XZ02和XZ12主要是芽孢杆菌和假单胞菌为主，不同采样点土样中的细菌群落结构的多样性和分布上都有差异。Liu等[27]对我国东北黑土农田细菌群落结构研究发现酸杆菌的相对丰度平均为24.11%，是黑土农田中第二大细菌群，仅次于变形菌(29.93%)。褚海燕[28]研究了小麦田间微生物群落的组成、多样性和分布，结果表明放线菌、酸杆菌和变形菌是华北平原小麦细菌群落的优势菌群。不同地区农田土壤细菌群落结构有一定差异，拉萨地区农田土壤细菌中变形菌门和厚壁菌门数量较小，与其他一些研究[29-31]形成差异。

本研究发现不同时期各样品的Shannon指数和OTU数量均值大小为Group 1(播种前期)

本研究发现拉萨河谷地区农田土壤优势种群的酸杆菌、放线菌、芽单胞菌，还有很多细菌菌群未命名，其功能仍不清楚，还须进行更深入的研究。