大连典型浴场海水中粪源指示细菌和土著病原弧菌的流行分布

明红霞， 张颖雪,2， 金 媛， 苏 洁， 石 岩,2， 樊景凤

(1. 国家海洋环境监测中心， 大连 116023； 2. 大连海洋大学 水产与生命学院， 大连 116023)

弧菌属是海洋环境中的土著微生物，在目前发现的30余种弧菌中,至少有12种对人类具有致病性，常引起严重腹泻和脱水。其中，创伤弧菌和副溶血弧菌是最常见的弧菌病的病原[1]，而霍乱弧菌作为人类霍乱的病原体能引起世界性大流行，每年约有286万感染病例，死亡人数达9.5万[2]。由于气候变化的影响，弧菌在环境中的存活条件发生了改变，导致其分布范围扩大，致病性增强[3]。

海水浴场作为重要的公共场所，近20年来弧菌疾病暴发案例显著增加[4]。因此，保护公众因暴露于被污染的娱乐用水而导致弧菌感染至关重要。目前国内外普遍采用的娱乐用水微生物评价指标——粪便污染指示细菌(FIB)并不能保护免受因弧菌感染导致的人体健康威胁[5-7]，主要原因是弧菌为海洋土著细菌，其浓度及其发病率主要受环境条件控制，而与外源粪便污染无关，这些环境条件也可能是导致弧菌病具有地域性或季节性[8]。到目前为止，其主要的环境影响因子尚不清楚[9]。因此，为更好保护公众健康，本研究拟在开展海水浴场肠球菌评价的基础上，以3种常见的病原弧菌为研究对象，分析其毒力基因标志物的污染情况，同时对其主要环境影响因子进行探讨，以期为海水浴场疾病防控提供参考资料。

表1大连星海浴场和付家庄浴场采样站位信息

1 材料与方法

1.1 采样站信息及取样方法

大连星海浴场和付家庄浴场为大连市内2个典型的海水浴场，日均客流量分别达4万和2万人，旅游高峰期可达5万～6万人，浴场卫生状况对游客至关重要。本研究选取这2个浴场为研究区域，按照平均布设且兼顾游泳人群密集区的原则，在距离岸边约20 m的断面，每隔50～100 m布设站位(表1)，于8月份至9月份游泳高峰季节，每逢周末或降雨后12 h内采集表层海水，星海浴场第一年布设5个站位，第二年布设9个站位(采集2年)，付家庄浴场布设6个站位(采集1年)，共采集134个海水样品。每个站位采集表层海水3.5 L至无菌采样桶中，冷藏保存，并于2 h内运回实验室。采样同时记录天气状况，并现场用YSI测定水温、盐度等环境因子。

1.2 方法

1.2.1 肠球菌计数

参照ISO标准[10]中滤膜法检测海水中的肠球菌，用0.45 μm孔径的混合纤维素滤膜过滤100 mL水样，将滤膜贴于含叠氮钠的培养基上，于(36±2)℃培养(44±4) h，如果观察到红色、栗色或粉红色菌落，则用消毒的镊子将滤膜转移至胆盐-七叶苷-叠氮化物培养基上，于(44±0.5)℃培养2 h，观察并记录棕色或黑色菌落，每个样品设置3个平行。

1.2.2 海水浴场中3种典型弧菌的毒力基因标志物分析

样品处理：分别取1 L混匀样品用0.22 μm孔径的硝酸纤维素滤膜过滤，每个样品设置3个平行。

DNA提取：用无菌剪刀把滤膜剪碎，采用Qiagen 强力土壤提取试剂盒(DNeasy power soil kit)提取细菌DNA，具体操作参照试剂盒说明书。

引物设计：分别根据霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的毒力基因hlyA、trh和vvh设计引物，分析其毒力基因标志物的污染情况，引物信息、PCR反应体系和反应条件参照郭建丽[11]和石岩[12]的研究。

结果确认：经PCR反应后，用2%的琼脂糖电泳检测，如果确定反应为阳性，则进行克隆测序，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序确认，所得序列在GenBank数据库中用BLAST进行检索和同源性比较。

1.2.3 数据分析

为进一步分析粪便污染指示细菌肠球菌与3种病原弧菌、以及各细菌学指标与主要影响因子之间的关系，采用SPSS(V20.0)进行Pearson相关性检验。

2 结果

2.1 天气状况

采样期间记录了天气状况，风速范围为0.3～7.9 m/s，风级为1～4级，气温为19.1 ℃～28.6 ℃，浪高为0.2～1.0 m，共记录了5次降雨，结果详见表2。

2.2 肠球菌的分布

经分析，在所采集的134份样品中，大连付家庄浴场和星海浴场肠球菌的浓度在0.3～12 000 CFU/100 mL之间，其中，付家庄浴场海水中其浓度范围为3.3～5433 CFU/100 mL，平均浓度为997 CFU/100 mL，星海浴场海水中其浓度范围为0.3～12 000 CFU/100 mL之间，平均浓度为1136 CFU/100 mL。根据美国环保署现行标准[13](肠球菌的浓度≤104 CFU/100 mL)，大连付家庄浴场和星海浴场肠球菌的超标率分别为66.7%(n=30)和55.8%(n=104)。

表2 采样期间天气状况

本研究在付家庄浴场共采集5批次样品，星海浴场共采集16批次样品，其肠球菌分布详见图1和2。付家庄浴场降雨后(n=1)肠球菌平均浓度达3717 CFU/100 mL，而降雨前2 d其平均浓度为131 CFU/100 mL，降雨后星海浴场肠球菌平均浓度为2298 CFU/100 mL(n=4)，而降雨前2～3 d其平均浓度为53 CFU/100 mL。与晴天相比，降雨后(12 h内)肠球菌浓度显著升高(P<0.01)。星海浴场第3次采样前天夜里发生较大范围降雨(28 mm)，肠球菌浓度显著升高，虽然第4次采样前一天有小范围降雨(10 mm)，但因与第3次采样只有2 d间隔，肠球菌浓度并未继续升高，相比而言，第5次采集的涨潮时样品中肠球菌浓度反而较高，该情况与第8次采样结果类似。

2.3 3种病原弧菌毒力基因标志物的分布

两个典型海水浴场中副溶血弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌的毒力基因阳性检出率为分别为24.6%、4.5%和10.4%，各浴场检测结果详见表3。3种弧菌的毒力基因在降雨前后无显著差异，同一浴场不同站位之间分布也无显著差异。其中，副溶血弧菌在两个浴场所有站位均有检出；除个别站位(F2、F5、F6、X9)外，创伤弧菌在两个浴场其余站位也均有检出；除个别站位(F6)外，付家庄浴场在其余5个站位均有霍乱弧菌检出，但是该病原菌在星海浴场各站位均未检出。

图1 大连付家庄浴场各采样站位肠球菌的分布

2.4 指示细菌与3种病原弧菌的关系

分析数据表明，在134个样品中，有78个样品肠球菌超标，其中有18个样品检出了副溶血弧菌毒力基因，占副溶血弧菌阳性检出率的54.5%(18/33)；有4个样品为创伤弧菌阳性，占创伤弧菌阳性检出率的28.6%(4/14)；有3个样品为霍乱弧菌阳性，占霍乱弧菌阳性检出率的50%(3/6)。

表3 大连付家庄浴场和星海浴场表层海水中 弧菌毒力基因标志物检测结果

图2 大连星海浴场各采样站位肠球菌的分布

Figure 2 Distribution of enterococci at each sampling site in Xinghai bathing beach

SPSS相关性检验结果表明(表4)，肠球菌与创伤弧菌呈负相关关系，与副溶血弧菌和霍乱弧菌无相关性，而这两种弧菌则呈显著正相关关系。由此可见，肠球菌与3种病原弧菌的生态特征差异较大。而在3种弧菌中，副溶血弧菌与霍乱弧菌生态特征较为相近。

表4 Pearson相关性检验细菌学指标之间以及其与环境因子的相关性

注：对霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、肠球菌等生物学指标以及降雨量、水温、pH值、盐度、透明度、浊度、叶绿素a、DO等指标进行了Pearson相关性分析，其中“*”代表相关，“**”代表显著相关

2.5 主要环境、气象影响因素的筛选

选取水温、pH值、盐度、透明度、浊度、叶绿素a、DO、潮汐、风速、风向、降雨量等指标，采用SPSS(V20.0)进行Pearson相关性检验，分析了细菌学指标的主要环境、气象影响因素。结果表明(表4)，肠球菌与风速、浪高、降雨量均呈显著正相关关系，与DO、pH值、透明度均呈负相关关系。副溶血弧菌与浪高呈显著负相关关系，与pH值呈正相关关系，创伤弧菌与盐度、透明度呈显著正相关关系，与水温、气温呈负相关关系。而本研究中霍乱弧菌与所测环境因子均无相关性。通过细菌学指标与环境、气象要素相关性分析进一步证明，肠球菌与3种弧菌的生态学差异较大，不能用肠球菌来指示3种弧菌的污染。

3 讨论

目前国内外海洋娱乐用水标准均采用粪大肠菌群、肠球菌等指示细菌来保护公众暴露于粪源病原细菌的安全[13-15]，然而，海洋土著微生物在娱乐安全用水中同样发挥着重要的作用。我国对病原弧菌的关注主要集中在临床、养殖生物和养殖水体中[16-18]，因缺少相关流行病学调查和临床数据分析，海水浴场中病原弧菌的感染风险尚未引起足够的重视，目前仅见雷铠璐等人对青岛第一和第六海水浴场中的副溶血弧菌和创伤弧菌进行了分析[19]，王若纯等人对青岛沿海浅水中溶藻弧菌的分布研究[20]，但均基于选择性培养基对弧菌的筛选，虽然已结合生理生化鉴定，但是并不能确定其致病性。

随着分子生物学的发展，国内外大多数根据毒力基因来研究环境中病原弧菌的分布特征[21]。本研究显示，在大连付家庄浴场和星海浴场中副溶血弧菌的毒力基因检出率最高(24.6%)，其次是创伤弧菌，检出率最低的是霍乱弧菌。副溶血弧菌和创伤弧菌的毒力基因在大连两个海水浴场中的分布差异不大，而霍乱弧菌只在付家庄浴场检出。不同的弧菌地理分布差异较大，可能与盐度、温度、营养成分以及或原生动物捕获等因素有关[22-23]，同时与采样当时的天气现象，如浪高、风速等有关。本研究结果也显示不同弧菌的主要环境影响因子也不相同，进一步导致其生态学分布特征的差异。

研究表明，创伤弧菌是最危险的弧菌病原，其感染后死亡率可高达20%～25%，如果感染过程伴有败血症，其死亡率可高达60%[24]。霍乱弧菌(non O1/O139)是第二大危险弧菌病原，虽然其死亡率较低，但在高危人群中，死亡率会显著增加——尤其是老人、肝病患者和免疫系统受损者[25]。与上述两种弧菌相比，副溶血弧菌造成的死亡人数最少，在娱乐用水中常导致伤口和耳朵感染[26]。本研究通过检测弧菌毒力基因标志物，证明3种弧菌在大连代表海水浴场中均有潜在的感染风险。由此可见，目前仅用粪便污染指示细菌来评价浴场水质安全状况难以保证公众安全，亟须开展常见病原弧菌的毒力基因标志物分析。此外，我国乃至世界范围内对弧菌的风险评估工作还停留在食品安全领域[27]，尚无适用于海水浴场常见弧菌的风险评估模型[28]，因此未来亟须加强该领域的研究，实现弧菌的人体健康风险评估，预防和减少相关疾病的发生。