牛肉卤制过程中蛋白质组分的变化及其对品质的影响

李湘銮，刘巧瑜，赵文红，杨娟，白卫东*，胡松青

1(仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州，510225)2(华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州，510640)3(广州市广式传统食品加工与安全控制重点实验室，广东 广州，510225)

卤制品是我国特色加工肉制品，其消费呈现逐年增长的趋势。卤制品特征鲜明，具有浓郁的卤汁香味、悠长的回味、软烂的质地口感，常用作开胃菜、冷菜和即食休闲食品，深受广大消费者的喜爱。牛肉是卤制品加工常用的原料。

蛋白质是牛肉中最主要的成分，具有广泛的功能特性，可形成网络与结构，可与其它成分协同，在肉制品质地、滋味与营养品质的形成中发挥重要作用[1-3]。肌原纤维蛋白不仅对肉制品持水性具有重要的影响[4]，也和骨架蛋白决定肉的肌原纤维强度[5]。水是食品体系中最重要的成分，对食品的加工变化、产品品质和储存稳定性具有重要的影响[6]。牛肉中大部分水因毛细管的束缚存在于肌原纤维中。水的运动性对产品的稳定性具有关键的影响。核磁共振(nuclear magnetic，NMR)是一种无损检测方法，可用于分析水质子的运动性和分布[7-8]。

牛肉卤制过程中，一方面蛋白质受热变性，导致蛋白质-水相互作用的变化以及肌肉纤维横纵向的收缩变化，使其水结合能力下降[9-10]，从而改变卤牛肉质地特性和水分分布，有助于肉制品品质的形成。另一方面，蛋白质降解生成游离氨基酸和肽。这些降解产物是风味化合物的前体物质，对卤牛肉的滋味具有一定影响[11]。蛋白质占卤牛肉干重的55% 以上，但关于牛肉在卤制过程中蛋白质组分的变化情况，以及是否影响卤牛肉品质的研究较少，且作用机理尚不清楚。

为探讨蛋白质在卤牛肉滋味、水分分布和品质形成中的作用，本文研究了牛肉卤制过程中蛋白质组分的变化，并分析其对卤牛肉理化特性的影响，以期为优化牛肉卤制工艺提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛后腿肉：鲁西黄牛(18月龄)，广东清远牧原养牛场。

NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、NaOH、三氯乙酸(TCA)、甲醇，均为分析纯，国药集团有限公司。

生姜、洋葱、花椒、二锅头(酒精度为46%)、食盐均为食品级，市购。

1.2 仪器与设备

Eppendorf 5418高速冷冻离心机，艾本德中国有限公司；Agilent 1200型高效液相色谱，美国安捷伦科技有限公司；K9860型全自动凯式定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；TA-XTPlus质构仪，英国Stable Micro Systems公司;MesoMR23-040H-I核磁共振成像分析仪，苏州纽迈分析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 牛肉卤制方法

将100 g生姜汁、100 g洋葱汁、10 g花椒、200 g二锅头和300 g食盐拌和均匀，制得腌制剂。牛肉切成10 cm×10 cm×3 cm的规格，用10%腌制剂(质量分数)0～4 ℃腌制24 h，然后放入1.8倍体积的卤汁中于95 ℃分别卤制60、90、120、150和180min。

1.3.2 各蛋白质组分的分离提取与测定

参考VISESSANGUAN的方法[12]，并稍作修改。4.00 g样品加入10倍体积的提取液A(15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5)，9 500 r/min均质1 min，10 000 r/min离心20 min。上清液加入冷却的50% TCA至最终浓度为10%，10 000 r/min离心15 min，上清液和沉淀分别为非蛋白氮和水溶蛋白。沉淀中加入10倍体积的提取液B(0.45 mmol/L KCl、15.6 mmol/L KH2PO4、3.5 mmol/L Na2HPO4，pH 7.5)，9 500 r/min均质1min，然后10 000 r/min离心15 min，重复离心2次。上清液为盐溶蛋白。沉淀加入10倍体积0.1 mol/L NaOH，10 000 r/min离心15 min，所得上清液和最终的沉淀分别为碱溶蛋白和碱不溶蛋白。蛋白质含量测定采用凯氏定氮法(GB5009—2010)。

1.3.3 游离氨基酸分析方法

参照CEYLAN的方法并适当调整[13]，采用HPLC测定。精准称取4.00 g样品加入三氯乙酸40 mL，9 500 r/min匀质1 min，再用双层滤纸过滤。滤液于4 ℃条件下10 000 r/min离心30 min，然后取1 μL上清液进样分析。

HPLC测定条件：色谱柱为ODS HYPERSIL柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；采用邻苯二甲醛和9-甲基氯甲酸酯进行柱前衍生化处理；流动相A：20 mmol/L醋酸-醋酸钠溶液(pH 7.2)，流动相B：V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1。流动相流速1 mL/min，柱温40℃。

1.3.4 水分含量测定

按照GB 5009.3—2016食品安全国家标准 食品中水分的测定中的直接干燥法[14]。

1.3.5 LF-NMR横向弛豫时间(T2)测定

整块样品放入60 mm的检测线圈内在室温下测定NMR弛豫时间波谱，采用CPMG序列采集。操作条件：TR=500 ms，NS=4，Echo Time=100 μs，Echo Count=2 500。数据采用PQ001软件分析。

1.3.6 质构分析(TPA)

卤牛肉自然冷却至室温，切成3 cm×3 cm×3 cm的方块。采用TA-XTPlus质构仪测定样品的质构。测定参数：探头P5，测试前速度3 mm/s，测试后速度2 mm/s，测定间隔时间20 s，探头距离20 mm。

1.4 数据分析

每个试验重复做3次，取3次平行测定的平均值，采用SPSS 11.0软件分析数据间的显著性差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 牛肉卤制过程中蛋白质组分的变化

根据蛋白质溶解性的不同，牛肉中的蛋白质可分成NPN、水溶性蛋白、盐溶性蛋白、碱溶蛋白和碱不溶蛋白。NPN主要由氨基酸和肽组成。水溶蛋白主要由肌浆蛋白组成，包括磷酸化酶、肌酸激酶以及磷酸甘油激酶[15]。盐溶蛋白主要由肌球蛋白重链、肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白等多种肌原纤维蛋白组成。碱溶蛋白主要包括变性的肌动球蛋白和胶原蛋白的降解物[16]。碱不溶蛋白由胶原蛋白和弹性蛋白等大分子质量基质蛋白组成。

如图1所示，牛肉在卤制过程中，NPN含量逐渐增大(P<0.05)。由于蛋白质降解产生肽和游离氨基酸，导致NPN含量增大。而水溶蛋白、盐溶蛋白以及碱溶蛋白均显著下降(P<0.05)，表明这部分蛋白质在热的作用下大量降解并部分地溶于卤汁中。碱溶蛋白是牛肉中的最主要蛋白质组分。盐溶蛋白在加热过程中部分舒张并形成网络，部分亲水性基团可能暴露于蛋白质的表面，从而提高牛肉的持水能力。蛋白质总量的下降是水溶蛋白、盐溶蛋白和碱溶蛋白的共同下降的结果。碱不溶蛋白的含量高于其它蛋白质组分，且不溶于卤汁，故其下降速率缓慢(P>0.05)。

图1 牛肉卤制过程中蛋白质组分的含量Fig.1 Contents of protein fractions during processing of beef marinating注：不同指标小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)

2.2 牛肉卤制过程中游离氨基酸的变化

卤制过程中，游离氨基酸总量在60 min时显著增大(P<0.05)，90 min时明显减少(P<0.05)，随后显著增大(P<0.05)(表1)。游离氨基酸总量从2 677.4 mg/kg显著增加到3 370.3 mg/kg，这是由于蛋白质的降解和卤汁中的氨基酸扩散到牛肉中。

卤牛肉滋味的鲜味程度与肌肉中呈味氨基酸的含量和组成有关[17]。鲜味氨基酸主要为谷氨酸和天冬氨酸。卤制过程中，谷氨酸的含量明显地连续增大(P<0.05)，由此导致游离氨基酸总量的增加。卤牛肉中增加的谷氨酸主要来自于卤汁中味精和酱油的添加，它们的主要成分为谷氨酸钠。丙氨酸含量显著地连续下降(P<0.05)，导致甜味氨基酸总量的下降。这表明大量的氨基酸溶于卤汁中或降解。而苦味氨基酸总量变化不明显，其中甲硫氨酸和半胱氨酸是肉味风味的前提物质，在卤制过程中经Strecher降解生成不同的含硫化合物，从而产生含硫的挥发性前体物质。因此卤制过程中谷氨酸和游离氨基酸总量的增加有助于卤牛肉滋味的形成。

游离氨基酸的相互作用有助于形成肉品特有的滋味[18-19]。缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸可明显加强滋味的强度[20-21]。游离的赖氨酸、酪氨酸和天冬氨酸与肉的老化滋味具有明显关系[22]。

表1 牛肉卤制过程中游离氨基酸的含量 单位：mg/kgTable 1 The content of free amino acids during processing of beef marinating

注：同一行中上标字母不同表示彼此间差异显著(P<0.05)(下同)

2.3 牛肉卤制过程中水分含量的变化

卤制过程中，牛肉中的水分含量呈逐渐下降趋势(P<0.05)(表2)。牛肉中的大部分水因毛细管的束缚存在于肌纤维中。热诱导的蛋白质的变性和结构性收缩降低蛋白质的持水能力。肌球蛋白约占肌原纤维蛋白总量45%，是热稳定性最低的结构蛋白，在 40～60 ℃便开始变性[23]。蛋白质含量的变化(图1)显示，卤制过程中牛肉中的蛋白质逐渐变性、降解、溶于卤汁中，导致牛肉中的水分大量析出。

表2 牛肉卤制过程中水分含量的变化Table 2 The change of moisture content during processing of beef marinating

2.4 牛肉卤制过程中水分分布的变化

2.4.1 牛肉卤制过程中横向弛豫时间T2的变化

根据水分存在的状态，依次可分为结合水(T21)、不易流动水(T22)和自由水(T23)。如图2所示，未卤制牛肉的图谱中只有2个峰，卤牛肉的图谱中出现3个峰，表明未卤制牛肉中水分的存在状态不同于卤牛肉的。T22信号强度和峰面积最大，说明牛肉中的水分主要为不易流动水。

图2 牛肉卤制过程中弛豫时间T2分布图Fig.2 Distribution of transverse relation time T2 during processing of beef marinating

横向弛豫时间T2可以反映水分的自由度，T2越大，水分自由度越大。如表3所示，牛肉卤制过程中，T21的弛豫时间无明显差别(P<0.05)，说明这部分结合水很稳定，不受蛋白质降解的影响。T22在初始的90 min显著地下降(P<0.05)，随后保持不变。卤制过程中，一方面盐溶蛋白部分舒张并形成网络，部分亲水性基团暴露于蛋白质的表面，从而降低不易流动水的自由度。另一方面因蛋白质的降解，肽和氨基酸浓度增大，由此提高了细胞内渗透压，增强牛肉的持水能力。T23在60～90 min与120～180 min均保持不变，但随着卤制时间的增加，自由水的水分活度增强 (P<0.05)。自由水主要存在于毛细管中。重建的蛋白质网络形成新的毛细管，部分不易流动水转变成自由水并存在于新产生的毛细管中，导致蛋白质持水能力的下降。鲜牛肉中未检测出自由水，这是由于为去除牛肉中的血水，牛肉卤制前进行出水处理。出水过程中，由于蛋白质的变性及结构收缩，牛肉中的自由水完全析出。

表3 牛肉卤制过程中横向弛豫时间T2Table 3 Transverse relaxation times T2 during processing of beef marinating

注：ND表示未检出；同一列中上标字母不同表示彼此间差异显著(P<0.05)(下同)

2.4.2 牛肉卤制过程中水分分布的变化

根据峰面积变化可以得到卤制过程中不同状态水分含量及迁移情况[24]。牛肉中水的总峰面积连续地显著变小(P<0.05)，这与T22峰面积的变化趋势一致(表4)。不易流动水占牛肉中总水分含量的90%，所以总峰面积受T22峰面积的影响。卤牛肉中结合水T21的峰面积明显地高于未卤制牛肉的(P<0.05)，卤牛肉间结合水的峰面积几乎无差异(P>0.05)。因蛋白质水解而新暴露的亲水基团与新产生的肽促进蛋白质的水化作用[24]，导致牛肉中结合水的含量增大。T22的峰面积逐渐下降(P<0.05)，由于不易流动水存在肌原纤维内，牛肉中肌纤维蛋白在40～75 ℃时开始变性，热收缩导致肌纤维间距的减少，导致不易流动水含量下降，蛋白质持水能力的下降。T23的峰面积明显地波动(P<0.05)，150 min时达到最大值。不同状态的水的比例因蛋白质数量与性质的不同而不同，导致卤制过程中牛肉中结合水、不易流动水和自由水的相对含量出现不规则变化，以及相对含量的变化趋势有别于峰面积的变化。

2.5 牛肉卤制过程中质构的变化

质构是表征牛肉的嫩度指标之一。如表4所示，卤制过程中牛肉的剪切力和硬度逐渐减小且差异显著(P<0.05)，说明牛肉的嫩度越高。加热使胶原蛋白的溶解度增大，肌束膜的胶原纤维受热发生变性，破坏肌束膜结构的完整性，结缔组织被破坏，从而提高牛肉的嫩度。牛肉的黏性显著性下降(P<0.05)。牛肉的黏性与强度随着肌原纤维蛋白含量的降低而下降。牛肉的弹性和黏聚性略降低(P>0.05)。牛肉蛋白质组分变化显著影响肉的质地。牛肉中结构性蛋白主要为胶原蛋白、肌原纤维蛋白和肌球蛋白，蛋白质的热变性和降解改变其结构，从而降低肌纤维的机械强度和的凝胶能力，导致肉的剪切力、硬度、黏性和黏聚性下降[25]。这些变化也形成卤牛肉软烂质地口感。

表4 卤制过程中牛肉水分的分布(mean±SD，n=3)Table 4 Corresponding relative populations during processing of beef marinating

表5 牛肉卤制过程中质构变化Table 5 Change of texture during processing of beef marinating

注：同一列中上标字母不同表示彼此间差异显著(P<0.05)

3 结论

蛋白质的变性及降解使其含量与持水能力的下降，导致卤制过程中牛肉中大量的水分析出到卤汁中(P<0.05)。牛肉在卤制过程中，NPN含量逐渐增大(P<0.05)，而水溶蛋白、盐溶蛋白、碱溶蛋白及蛋白总量均显著下降，与蛋白质在热的作用下大量降解产生肽和游离氨基酸并部分地溶于卤汁中有关。卤汁中的谷氨酸大量扩散到牛肉中导致卤牛肉中谷氨酸含量及游离氨基酸总量的显著增大(P<0.05)。卤制过程中，牛肉中的水分含量逐渐下降(P<0.05)。水分以结合水、不易流动水和自由水的状态在卤牛肉均匀分布，不易流动的水分自由度明显高于结合水的(P<0.05)。卤制过程中结合水缓慢下降(P>0.05)；不易流动水的含量快速下降(P<0.05)，自由水的含量明显地波动(P<0.05)。卤制后，牛肉的剪切力、硬度、黏性均明显下降(P<0.05)，弹性和黏聚性均略下降(p>0.05)。这些变化促进卤制过程中卤牛肉滋味、质地特征的形成。