非酒精性脂肪肝病情程度与血清CK-18及肝纤维化指标的相关性

张蓓琳,黄玉伟,符策月,蔡雷鸣,王斌

(上海市第一人民医院宝山分院消化内科，上海 200071)

近年来，随着我国经济发展和人们生活水平的提高，饮食结构发生改变，非健康行为人群中诊断为非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的概率明显升高。NAFLD是排除乙醇及其他明确因素所致，以影像学或组织学形式表现出弥漫性大泡性肝细胞脂肪变性和直至贮存特征的临床病理综合征[1]。多数NAFLD患者的病理变化为单纯性脂肪肝，是各种慢性肝病进展至终末期肝硬化的必经阶段[2]，因此早期诊断至关重要。

NAFLD严重威胁着患者生命健康。目前对NAFLD的诊断仍以病理肝活组织检查结果为“金标准”，但后者因有创性操作而不适宜在临床广泛开展和应用，且费用较高，诊断结果可能因取样部位等有一定的偏倚，对医疗机构的病理检测水平也有一定的要求。Ⅲ型前胶原(procollagen type Ⅲ,PCⅢ)、透明质酸(hyaluronicacid,HA)等是临床评估肝脏疾病患者病情进展及肝功能状况的常用实验室指标。研究发现，细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK-18)在肝细胞代谢中具有重要作用[3]。目前，寻求用于早期诊断NAFLD的无创性、可重复性的诊断价值高的指标，是临床研究的热点。有研究发现，不同病情程度的NAFLD患者血清CK-18 M30水平也不同[4]。因此，监测CK-18 M30蛋白片段的表达水平对于判断NAFLD的病情进展程度具有一定的临床价值。不同病情程度的NAFLD患者肝纤维化实验室指标的检测结果也不同[5]。因此，本研究主要分析NAFLD不同病情程度与血清CK-18和肝纤维化指标的相关性，旨在为临床早期评估NAFLD病情提供无创指标。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年1月至2018年8月上海市第一人民医院宝山分院收治的100例NAFLD患者作为研究对象，按照NAFLD病情程度不同分为轻度组(37例)、中度组(33例)、重度组(30例)。病情程度划分标准[6]：轻度为肝脏密度降低，肝、脾CT值比值0.7～1.0；中度为肝内血管不清，肝、脾CT值比值0.5～0.6；重度为肝脏密度明显降低，肝、脾CT值比值≤0.5。选择同期体检健康的志愿者30名作为对照组。各组受试者性别、年龄、体质指数比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究经上海市第一人民医院宝山分院伦理委员会审核备案。

表1 各组受试者一般资料比较

NAFLD:非酒精性脂肪肝；a为χ2值，余为F值

1.2纳入与排除标准 纳入标准：①根据肝脏超声、CT的检查结果,符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[7]中 NAFLD的诊断标准。②年龄18～70岁。③患者均签署了知情同意书。排除标准：①合并重要器官的功能障碍；②酒精性肝病；③病毒性肝炎、药物性肝炎(甲氨蝶呤、糖皮质激素等所致)、自身免疫性肝病等其他原因所致的肝脏疾病；④合并急慢性感染、胆管疾病、免疫系统疾病，肝脏或其他系统的恶性肿瘤；⑤精神类疾病，无法正常配合研究；⑥近期(<1个月)服用了可能影响肝细胞色素P450酶功能的药物。

1.3方法 所有受试者于晨起空腹(8 h后)采集肘静脉血4 mL，以离心半径15 cm，3 000 r/min离心10 min，取1 000 μL上清液，保存于-70 ℃冰箱，待统一检测(3个月内)CK-18及肝纤维化指标[PCⅢ、Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ,CⅣ)、层粘连蛋白(laminin,LN)、HA]。①血清CK-18含量：根据酶联免疫吸附试验法检测受试者血清CK-18含量，应用KHBST-360酶标仪(上海科华实验系统有限公司)，严格按照说明书操作，在450/540 nm波长下读取吸光度(A)值，由标准曲线计算CK-18的含量(浓度)，检测试剂盒购自美国R&D公司(批号：20140709)。②肝纤维化指标：根据电化学发光法和夹心酶联免疫吸附试验法检测受试者肝纤维化指标(PCⅢ、CⅣ、LN、HA)，电化学发光法所用仪器为Centaur CP电化学发光免疫分析仪(美国拜耳公司)，严格按照说明书操作；夹心酶联免疫吸附试验法试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司(批号：20140513)，并严格按试剂盒说明书进行操作。

1.4观察指标 比较各组血清CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA的表达水平，分析NAFLD患者病情程度与CK-18及肝纤维化指标的相关性。

2 结 果

2.1各组血清CK-18和肝纤维化指标的比较 各组血清CK-18和肝纤维化指标(PCⅢ、CⅣ、LN、HA)比较差异有统计学意义(P<0.01),NAFLD轻度、中度、重度组血清CK-18和肝纤维化指标高于对照组，NAFLD中度和重度组高于轻度组，NAFLD重度组高于中度组(P<0.05)。见表2。

2.2NAFLD病情程度与血清CK-18及肝纤维化指标的相关性分析 Spearman等级相关分析结果显示，NAFLD病情程度与CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA均呈正相关(rs=0.618，P<0.001；rs=0.215，P=0.027；rs=0.506，P=0.004；rs=0.579，P<0.001；rs=0.528，P=0.001)。

3 讨 论

目前，NAFLD发病率已超过酒精性肝病和病毒性肝病，但NAFLD的发病机制目前尚不完全明确，目前认为其与多种基因的遗传、相关疾病、生活习惯、环境等因素有关，临床尚无靶向治疗药物，但中心性肥胖与NAFLD严重程度密切相关。NAFLD病理特征主要为弥散性肝细胞大泡性脂肪变，无明确肝损伤,非长期饮酒所致。从病理类型划分，NAFLD包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬化。NAFLD患者肝内脂肪酸60%来自脂肪组织的非酯化脂肪酸、其余部分来自肝内脂肪生成和饮食中，早期NAFLD患者无明显临床症状[8]。在NAFLD病情发展中，肝细胞在脂质的长期浸润下可发生变性、坏死，最终可形成肝组织纤维化，导致肝硬化[9]。NAFLD患者的最终临床结局可能发展成肝细胞癌。因此，对于NAFLD的早期诊断极其重要。近年来,有关血清标志物诊断NAFLD的研究逐渐增多，研究热点均集中在如何减少肝活组织检查、开展无创的诊断和评估肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化疾病过程的临床应用。

组别例数CK-18(ng/L)PCⅢ(μg/L)CⅣ(μg/L)LN(μg/L)HA(μg/L)对照组373.9±1.194.9±18.053.8±13.283.9±18.579.4±12.4NAFLD轻度组339.1±3.3a 116.2±26.8a57.8±12.1a98.6±27.5a82.6±17.4aNAFLD中度组3012.0±5.0ab128.2±29.6ab73.3±16.9ab112.1±25.2ab91.2±18.7abNAFLD重度组3013.7±5.3abc132.7±47.9abc86.2±23.9abc134.5±22.1abc122.4±25.8abc F值40.377 9.747 25.242 27.474 34.226P值<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

NAFLD:非酒精性脂肪肝；CK-18：细胞角蛋白18；PCⅢ：Ⅲ型前胶原；CⅣ：Ⅳ型胶原；LN：层粘连蛋白；HA：透明质酸；a与对照组比较，P<0.05；b与NAFLD轻度组比较，P<0.05；c与NAFLD中度组比较，P<0.05

NAFLD与胰岛素抵抗及遗传易感性相关[10-11]。以往研究表明，NAFLD发病由多重病因所致，包括高体质指数、高胰岛素水平及甲状腺水平异常等[12]。凋亡是肝细胞死亡的主要方式。CK-18可维持肝细胞正常结构、预防机械或非机械性的损伤,与肝细胞凋亡相关[13]。当肝细胞凋亡时，血循环中CK-18含量随之升高，通过检测CK-18可预测相关疾病的发生、发展[14]。本研究结果显示，NAFLD轻度、中度、重度组患者血清CK-18水平高于对照组(P<0.05)。万艳等[15]研究发现，NAFLD患者血清中CK-18与丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶等呈正相关，能够准确地反映患者病变状态。本研究结果显示，不同病情程度NAFLD患者的血清CK-18水平比较差异有统计学意义，说明在NAFLD病程发展过程中随着随着胰岛素抵抗的进展，脂肪肝的病情逐渐加重，肝细胞凋亡程度加剧，因此CK-18在NAFLD病程发展过程中发生了显著性变化。童明富等[16]研究报道，临床可以通过检测血清中CK-18表达水平来评估NAFLD的病情程度。此外，本研究Spearman等级相关分析结果显示，NAFLD病情程度与血清CK-18呈正相关，提示临床可以通过检测血清CK-18评估NAFLD患者的病情程度。

肝纤维化几乎出现于所有慢性肝损伤后，是一个动态过程，由肝实质细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞等多种细胞及涉及的一系列细胞因子相互作用共同介导肝纤维化进程，是向肝硬化进展的必经阶段，多种慢性肝脏疾病的共同病理过程，也是多种慢性肝脏疾病的重要病理特征[17-18]。NAFLD病程向肝硬化发展的过程，是一种因细胞外基质(如非胶原糖蛋白、蛋白多糖)胶原成分过度堆积的病理过程。因此，有学者指出，对NAFLD患者肝纤维化指标的检测或可成为诊断NAFLD的重要指标[19-20]。本研究结果显示，NAFLD轻度、中度、重度组肝纤维化指标(PCⅢ、CⅣ、LN、HA)高于对照组(P<0.05)。肝纤维化指标中CⅣ、HA及LN均为血管和细胞的重要组成成分，能较敏感地反映肝纤维化状况。此外，本研究中NAFLD中度和重度组肝纤维化指标高于轻度组，NAFLD重度组高于中度组(P<0.05)，说明随着胰岛素抵抗的不断进展，NAFLD患者的肝功能呈不同程度的恶化，提示肝纤维指标可以反映NAFLD患者的肝纤维化程度。周琳等[21]探讨非酒精性脂肪肝与血清CK-18、肝纤维化指标的相关性，结果表明CK-18对NAFLD临床诊断具有一定价值，可作为NAFLD的独立预测因素。本研究相关分析结果显示，NAFLD病情程度与PCⅢ、CⅣ、LN、HA均呈正相关(P<0.05)，说明随着病情加重，NAFLD患者的肝纤维化指标均升高。

本研究中对NAFLD患者的最终诊断综合了实验室指标，并非经病理活组织检查而确诊，对纳入的100例NAFLD患者未做病理性分组，故本研究对NAFLD患者的分组存在一定的局限性。另外，本研究样本量较少，可能导致统计学结果的偏倚。

综上所述，临床可通过监测血清CK-18及肝纤维化指标水平来诊断NAFLD患者肝纤维化的病变及评估其病情程度，具有无创、可重复性的优点。