不同采收期坛紫菜中半乳聚糖硫酸酯的结构特征分析

张忠山， 王晓梅， 刘重斌， 王占旗， 潘永良， 张绍勇

(湖州师范学院 浙江省媒介生物学与病原控制重点实验室， 浙江 湖州 313000)

0 引 言

坛紫菜(Porphyrahaitanensis)，俗名乌菜，是中国特有的一种可人工栽培的海藻.作为浙江、福建和广东的主要栽培藻类，坛紫菜富含蛋白质、多糖和维生素等营养成分，素有“营养宝库”的美称[1].坛紫菜是分期采割的，采收期从秋后开始可持续到翌年2月份.整个采收期可以采收5～6茬，头茬称为头水或一水，口感最好，售价也最高.此后的几茬依次称为二水、三水至末水.越往后采收的坛紫菜，口感越差，获利也越少[2].产品口感与营养成分有很大关系，而营养成分随生长环境变化而变化.因此研究不同采收期坛紫菜的营养成分变化，对探索其口感变化具有重要意义.

坛紫菜中营养成分最多的是碳水化合物，它是决定坛紫菜口感的重要指标.碳水化合物包括纤维素、淀粉、半乳聚糖3类.坛紫菜通过光合作用的卡尔文循环产生的三碳糖经过二次分配合成上述3种碳水化合物，三者相互转化和代谢，共同调控坛紫菜的糖代谢流程.随着采收期的温度不断降低，三者会通过相关含量动态变化应答低温胁迫[3].研究发现，半乳聚糖占坛紫菜干重的20%～40%，是坛紫菜体内含量最多的营养成分.随着整个采收期内采收温度的降低，坛紫菜体内半乳聚糖的含量和结构必然发生改变，以适应低温胁迫的影响.本文测定不同采收期坛紫菜中几种多糖成分的含量变化，提取坛紫菜中的半乳聚糖硫酸酯进行成分测定和结构解析，探索不同采收期坛紫菜中半乳聚糖硫酸酯响应低温胁迫的调控变化，为解析其生物合成途径提供依据.

1 实验材料与方法

1.1 试剂与设备

Nicolet Avatar 360型红外光谱仪(美国Nicolet Instrument Corporation 公司)、LC-10A高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)、AVANCE 600-MHz核磁共振仪(瑞士Bruker公司)、凯氏定氮仪(上海沛欧分析仪器有限公司)、SP-752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、溴化钾(天津博君科技有限公司，光谱纯)，其他试剂均为分析纯.

1.2 实验材料

不同采收期的坛紫菜于2017年10月15日开始在浙江省温州市洞头养殖场采集，每20 d采集1次，共采集一水至六水6个样品，用海水洗净后，低温烘干备用.

1.3 营养成分检测

蛋白质含量测定采用凯氏定氮法[4]；纤维素含量测定采用中性洗涤剂法[5]；灰分含量测定采用高温灼烧法[6].

取各组坛紫菜藻体研磨成浆加盐酸溶液水解后，再加碱中和定容，用蒽酮硫酸法测定总糖含量；匀浆藻体加水提取后过滤定容，用蒽酮硫酸法测定半乳聚糖含量.经上述过程提取可溶性糖后的残渣经沸水浴煮沸，再加高氯酸提取后定容，用蒽酮硫酸法测定红藻淀粉含量[7].

1.4 半乳聚糖硫酸酯提取

称取粉碎的坛紫菜藻粉，加入一定量的甲醇浸泡后晾干，再加入40倍水于105 ℃加热提取3 h，过滤残渣后，上清液装入透析袋进行透析.透析液经旋转蒸发浓缩后加入4倍乙醇搅拌沉淀，经无水乙醇洗涤2～3次后干燥，即得半乳聚糖硫酸酯.

1.5 半乳聚糖硫酸酯化学成分检测

总糖含量测定采用苯酚硫酸法[7]；硫酸根含量测定采用明胶氯化钡法[8]；3,6-内醚半乳糖含量测定采用间苯二酚比色法[9].

1.6 仪器分析法

称取半乳聚糖硫酸酯粉末与适量的光谱纯溴化钾，经研磨混匀后压片，于400～4 000 cm-1波长范围内进行红外光谱扫描.样品配成一定浓度溶液于高效液相色谱仪(示差检测器)检测相对分子量.称取样品溶于一定量的D2O中，于核磁共振仪中，记录氢谱和碳谱信号，分析样品中的C、H类型和相关化合物的特点.

2 结果与讨论

2.1 不同采收期坛紫菜营养成分变化

不同采收期坛紫菜的基本营养成分见表1.由表1看出，不同采收期坛紫菜中各成分含量存在一定的变化规律.蛋白质是坛紫菜中重要的营养物质，随着采收期的延长，其含量逐渐减少，但总糖含量逐渐增加.几种碳水化合物的含量呈现不同的变化.随着采收期的推移，纤维素含量逐渐增加，这可能与温度和光照不断降低有关，纤维素合成酶在此过程中对其影响较大.前两个月内，坛紫菜中红藻淀粉的含量逐渐增多，12月后逐渐减少，衰老期含量下降至最低，说明坛紫菜中红藻淀粉的积累存在一个最适宜的温度，较低温度不利于红藻淀粉的合成.纤维素和红藻淀粉是坛紫菜应答低温胁迫的主要因子，其含量增加也是坛紫菜衰老的表现.半乳聚糖含量逐渐降低至稳定状态，这是因为坛紫菜中其他糖类物质积累以抵御低温胁迫，从而造成半乳聚糖含量下降.

表1 不同采收期坛紫菜的基本营养成分Tab.1 Nutritional composition of P. haitanensis at different harvest time

2.2 半乳聚糖硫酸酯化学成分检测

如表2所示，随着采收期的推移，坛紫菜半乳聚糖硫酸酯中总糖含量逐渐降低，3,6-内醚半乳糖含量逐渐增加，说明组织的老化有利于3,6-内醚半乳糖的合成.硫酸基含量先增加后减少，四水时达到最多，之后逐渐下降，这与硫酸基合成酶有关.各水坛紫菜中半乳聚糖硫酸酯分子量也有不同变化.从一水至四水，半乳聚糖硫酸酯分子量逐渐减小，四水后逐渐增大，但总体变化不大.

表2 不同采收期坛紫菜中半乳聚糖硫酸酯的化学成分和分子量Tab.2 Chemical composition and molecular weight of galactosan sulfate in P. haitanensis at different harvest time

2.3 红外光谱分析

图1为6个样品半乳聚糖硫酸酯的红外光谱.由图1可见，所有样品均具有多糖的基本特征.其中，3 405 cm-1和1 650 cm-1左右的峰是多糖OH伸缩和弯曲的振动吸收峰；930 cm-1处的峰代表3,6-内醚半乳糖的吸收峰，从一水至六水峰的强度逐渐增大，说明3,6-内醚半乳糖的含量有上升趋势；1 250 cm-1、1 360 cm-1和1 420 cm-1左右的峰代表硫酸基吸收峰，从一水至四水，其峰的强度有加大趋势，四水后有减小趋势，与化学分析的含量变化一致；820 cm-1左右的峰表明有6-硫酸基-半乳糖；1 540 cm-1左右的弱小峰表明有含氮化合物，且强度逐渐减小，说明蛋白质含量有所减少.

2.4 核磁共振波谱分析

图2为各采收期坛紫菜中半乳聚糖硫酸酯的核磁共振碳谱，表明所有样品都含有琼胶糖及其前体，即由1,3-β-D-半乳糖和1,4-3,6-内醚半乳糖-α-L半乳糖组成.59.5 ppm左右的峰是OCH3的信号，从一水至六水，该甲基信号逐渐增强.尤其对六水坛紫菜，70.6 ppm和73.4 ppm处的峰明显表明含有较多的6-OCH3-D-半乳糖，说明随着采收期的推移，D-半乳糖甲基化程度增加.根据琼胶糖及其前体的C1位(分别标记为A98.1 ppm和A*101.4 ppm)的相对强度，可以估算出琼胶糖前体在多糖中的比例.由图2看出，从一水至六水，琼胶糖前体的比例逐渐减少，3,6-内醚半乳糖含量逐渐增加.

图3是各采收期坛紫菜中半乳聚糖硫酸酯的核磁共振氢谱.3.30 ppm左右的信号是6-O-CH3-半乳糖残基中CH3的H化学位移.随着采收期的推移，该信号强度逐渐增强，代表6-O-CH3-半乳糖含量逐渐增多，与碳谱结果一致.微弱的3.50 ppm左右的信号为极少量的2-O-甲基-3,6-内醚半乳糖中甲基H的化学位移，从一水至六水，该信号强度逐渐增加，说明甲基化酶在起作用.

3 结 论

随着采收期的推移，水温逐渐降低，坛紫菜中各糖类物质发生不同的变化.推测认为这种变化是由系列酶或基因调控的.在采收前期，坛紫菜中半乳聚糖硫酸酯合成的是琼胶糖的生物前体.随着采收期的推移，L-半乳糖逐渐向3,6-内醚半乳糖转化，同时D-半乳糖的6位甲基化程度增加.在采收末期，坛紫菜内形成了琼胶糖生物前体与琼胶糖并存的情况.糖代谢作为植物体内生物代谢的中心，对植物的生长发育和抵抗胁迫具有重要的调节作用.低温胁迫下，不仅坛紫菜的糖含量发生变化，而且糖还能对生物膜起到保护作用，使渗透势降低，以维持细胞结构稳定.下一步将通过排除坛紫菜不同个体遗传特征后，利用低温胁迫对同一个体的糖代谢过程进行研究，以深入探讨坛紫菜糖代谢对低温胁迫的响应机制.