基于网络药理学和分子对接法探寻清宣止咳颗粒治疗儿童新型冠状病毒肺炎活性化合物

宗阳 姚卫峰 单进军 汪受传

摘要  目的：探尋清宣止咳颗粒治疗儿童新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的活性化合物。方法：借助中药系统药理学分析平台（TCMSP）检索清宣止咳颗粒中桑叶、薄荷、苦杏仁、桔梗、白芍、枳壳，陈皮、紫菀、甘草的化学成分和作用靶点。通过UniProt、GeneCards等数据库查询靶点对应的基因，进而运用Cytoscape 3.7.2构建化合物-靶点（基因）网络，通过DAVID进行基因本体（GO）功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，预测其作用机制。结果：化合物-靶点网络包含141个化合物和相应靶点292个，关键靶点涉及PTGS2、ESR1、HSP90AA1、CALM1、AR等。GO功能富集分析得到GO条目339个（ P <0.05），其中生物过程（BP）条目244个，细胞组成（CC）条目33个，分子功能（MF）条目62个。KEGG通路富集筛选得到96条信号通路（ P <0.05），涉及小细胞肺癌、非小细胞肺癌、T细胞受体信号通路等。分子对接结果显示槲皮素、山柰酚、木犀草素等核心化合物与新冠病毒的亲和力与推荐用药相似。结论：清宣止咳颗粒中的有效活性成分可能通过作用于PTGS2、HSP90AA1、ESR1等靶点调节多条信号通路从而抑制新型冠状病毒肺炎作用。

关键词  清宣止咳颗粒;新型冠状病毒肺炎;网络药理学;分子对接;槲皮素;山柰酚;木犀草素

Discussion on the Active Compounds of Qingxuan Zhike Granule in Treatment of Pediatric Coronavirus Disease 2019 Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Method

ZONG Yang1，2，YAO Weifeng3，SHAN Jinjun4，WANG Shouchuan4

（1 Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Suzhou 215009，China; 2 Suzhou Academy of Wumen Medical School，Suzhou 215009，China; 3 School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 4 Key Laboratory of Pediatric Respiratory Diseases （TCM），Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective： To explore the active compounds of Qingxuan Zhike Granule for treatment of pediatric Coronavirus disease 2019 （COVID-19）. Methods： With the help of the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP），the chemical constituents and action targets of mulberry leaf，peppermint，bitter apricot seed，platycodon root，debark peony root，orange fruit，dried tangerine peel，tatarian aster root，liquorice root in Qingxuan Zhike granules were retrieved.The genes corresponding to the target were queried through databases such as UniProt and GeneCards，and then Cytoscape 3.7.2 was used to build a compound-target （gene） network，gene ontology （GO） function enrichment analysis was perform through DAVID，based on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG ） Path enrichment analysis，its mechanism was predicted. Results： The compound-target network contains 141 compounds and 292 corresponding targets.The key targets are PTGS2，ESR1，HSP90AA1，CALM1，AR，etc.GO function enrichment analysis obtained 339 GO entries （ P <0.05），of which 244 were biological process （BP） entries，33 were cell composition （CC） entries，and 62 were molecular function （MF） entries.The KEGG Path enrichment analysis obtained 96 signal pathways （ P <0.05），involving small cell lung cancer，non-small cell lung cancer，and T cell receptor signaling pathways.The molecular docking results showed that the core compounds such as quercetin，Kaempferol，luteolin and the like had similar affinity to the COVID-19 virus as the recommended drugs. Conclusion： The active ingredients in Qingxuan Zhike granules may regulate multiple signaling pathways by acting on targets such as PTGS2，HSP90AA1，and ESR1，thereby inhibiting COVID-19.

Keywords  Qingxuan Zhike granules; Coronavirus disease 2019; Network pharmacology; Molecular docking ; Quercetin; Kaempferol; Luteolin

中图分类号：R272.5;R512.99 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.001

2019年底湖北省武汉市出现新型冠状病毒肺炎疫情。2020年2月11日，世界卫生组织总干事谭德塞在瑞士日内瓦宣布，将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“Coronavirus Disease 2019（COVID-19）”[1]，结构由上海科技大学饶子和/杨海涛课题组测定的新冠病毒3CL水解酶（Mpro）的高分辨率晶体结构（PDB ID：6LU7）。见图1。COVID-19患者的临床表现为：以发热、乏力、干咳为主要表现，鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见[2]。2020年2月19日，国家卫健委发布了《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》，以下简称第六版诊疗方案。针对COVID-19的治疗目前尚无特效药，第六版诊疗方案中采取了中西醫结合治疗的方案针对于轻、中、重度患者进行了分类治疗。中医药作为我国传统的文化瑰宝，它不仅有着完整的理论体系指导而且在历朝历代重大疾病尤其是特殊新疾病中都发挥着不可替代的作用，如何从中医药宝库中寻找出治疗COVID-19的中药处方以及活性化合物成为当下中医药科研工作者的当务之急。

针对COVID-19患儿，多个省份（湖南、广西、河南和辽宁等）出台了专门的儿童中医治疗方案，其中清宣止咳颗粒作为中期肺胃热盛者的推荐用药。清宣止咳颗粒由桑叶、薄荷、桔梗、白芍等9味中药组成的复方制剂，具有疏风清热、宣肺止咳的功效，用于小儿外感风热咳嗽，证见：咳嗽，咯痰，发热或鼻塞，流涕，微恶风寒，咽红或痛[3]。网络药理学是基于系统生物学的原理阐释疾病发展的过程，进一步利用网络平衡的整体观来认识药物与机体相互作用的一门学科，具有“多基因、多靶点”的特点[4]。网络药理学强调疾病的发生发展是一个长期、复杂的动态过程，并认为疾病的本质是复杂生物网络的失衡，亦即网络中的基因或其产物等多个靶点处于功能失衡状态，网络药理学开创了一种多靶点与多种疾病间复杂网状关系的新型模式，在复杂疾病发病机制及治疗靶标的研究方面具有重要的应用价值[5]。分子对接是利用计算机技术研究小分子间配体和受体生物大分子相互作用，预测其结合模式和亲和力进而实现基于结构的药物设计的一种重要的方式[6]。本研究拟通过网络药理学筛选出清宣止咳颗粒作用靶点进行聚类分析，得出清宣止咳颗粒中核心活性化合物，进而运用分析软件对化合物-靶点进行分子对接以及代谢通路分析等，为后期的深入研究以及新药开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究实验材料为数据库和分析软件，数据库包括中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP[7]（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、人类基因数据库GeneCards[8]（https：//www.genecards.org/），蛋白质靶点数据库Uniprot[9]（https：//www.uniprot.org/）、信号通路分析数据库DAVID[10]（https：//david.ncifcrf.gov/）和蛋白质结构数据库PDB[11]（https：//www.rcsb.org）;分析软件包括网络分析工具Cytoscape 3.7.2[12]、化合物结构绘制软件ChemBio Draw Ultra 14.0、分子对接软件Auto Dock Vina和分子对接作图软件PyMOL。

1.2 清宣止咳颗粒中化学成分收集 借助中药系统药理学分析平台，以“桑叶”“薄荷”“苦杏仁”“桔梗”“白芍”“枳壳”“陈皮”“紫菀”“甘草”检索清宣止咳颗粒中的化合物组成和靶点等信息。

1.3 清宣止咳颗粒中活性化合物级靶点的筛选    口服利用度（OB）是药代动力学研究中的重要参数，常用于新药研究中评价口服药物的成药性，类药性（DL）是指化合物与已知药物的相似性，是化合物能够成为药物的评价指标[13-14]。因此，运用TCMSP平台的OB值和DL值筛选功能，其中OB>30%且DL>0.18，筛选后得到每味药材的潜在活性成分，并通过ChemOffice软件绘制其二维结构备用。在此基础上，得到上述化学成分的相关靶点蛋白，并用Uniport数据库查询靶标对应的基因名。

1.4 化合物-靶点网络的构建 运用Cytoscape 3.7.2软件构建“成分-靶点”网络，通过Network Analyzer功能对网络节点中心性进行分析，以Degree值为筛选条件，Degree值越高，则该成分与更多的靶点相关，从而分析清宣止咳颗粒中的核心化合物和核心作用靶点。

1.5 核心靶点通路分析 将清宣止咳颗粒核心作用靶点的基因导入DAVID数据库，以 P <0.05进行GO功能及KEGG通路富集分析，得到清宣止咳颗粒活性化合物作用靶点的主要生物功能和通路过程，以及其与新冠肺炎潜在的关联关系与作用机制中可能性较大的通路，根据排序绘制条形图。

1.6 成分-靶点分子对接  先用ChemOffice软件构建化合物的3D结构保存为*mol2格式并使其能量最小化。从PDB数据下载新冠病毒的3D结构*PDB格式，运用PyMOL软件对蛋白质进行去水、加氢等操作，利用Auto Dock软件将化合物及靶蛋白格式转换为*pdbqt格式，最后运行Vina进行对接。

2 结果

2.1 活性化合物和靶点的筛选 通过TCMSP数据库检索后，符合条件OB≥30%，DL≥0.18的化合物共有199个。其中桑叶中29个，薄荷中10个，苦杏仁中19个，桔梗中7个，白芍中13个，枳壳中5个，陈皮中5个，紫菀中19个，甘草中92个。另外，根据TCMSP化合物靶点信息，共收录上述成分的作用靶点292个。清宣止咳颗粒中含有的前40个活性化合物基本信息见表1。

2.2 化合物-靶点网络分析 通过Cytoscape 3.7.2 Network Analyzer分析得出，化合物-靶点网络总共包括433个节点（141个化合物节点、292个靶点节点）和2 391条边。见图2。经过Degree打分排序可以得出，化合物-靶点网络中，Degree排名前5位的化合物分别是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL003896-7-甲氧基-2甲基异黄酮、MOL000392-芒柄花黄素，分别能与150、62、57、43、39个靶点蛋白发生相互作用。从靶点的角度，Degree排名前5位的是PTGS2、ESR1、HSP90AA1、CALM1、AR，分别能与115、88、87、83、78个化合物发生相互作用。

2.3 清宣止咳颗粒中交集化合物 由2.2可知清宣止咳颗粒中不同的中药里面存在相同的化合物的情况，通过在线韦恩图求得，除了桑叶和薄荷没有交集化合物之外，其他7味药之间均存在交集现象，尤 其是甘草，苦杏仁与甘草共有7种化合物。见图3、表2。

2.4 核心靶点的生物信息学分析结果 根据 P <0.05为筛选条件，DAVID中GO功能富集分析得到GO条目339个，其中生物过程（BP）条目244个，細胞组成（CC）条目33个，分子功能（MF）条目62个。见图4。

KEGG通路富集筛选得到96条信号通路（ P <0.05），涉及小细胞肺癌、非小细胞肺癌、T细胞受体信号通路等，其中小细胞肺癌通路涉及 PIK3CG-AKT1-CCND1-CASP9-PTGS2-RXRB-BCL2- RELA-RXRA-TP53-NOS2-CDK4-CDK2;非小细胞肺癌通路涉及PIK3CG-AKT1-MAPK1-CCND1-CASP9-RXRB-RXRA-TP53-CDK4;T细胞受体信号通路涉及PIK3CG-AKT1-MAPK1-TNF-MAPK14-RELA-JUN-GSK3B-CDK4。见图5。

2.5 清宣止咳颗粒中核心活性化合物作用于新冠病毒的分子对接结果分析 一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。分子对接结果显示清宣止咳颗粒中核心活性化合物与新冠病毒的分子对接亲和力均小于-20 kJ/mol，由此表明清宣止咳颗粒中核心活性化合物与新冠病毒有较好的结合活性。见表3、图6。

3 讨论

中医认为COVID-19属于“疫病”范畴，源于感受疫疠之气[16]。第六版诊疗方案将COVID-19分为医学观察期、轻型、普通型、重型、危重型和恢复期。治则治法拟为辟秽化浊，以祛邪为第一要义，以分消湿热、宣畅气机为主，把住早期、进展期治疗是减少危重症、降低病死率的关键[17]。从清宣止咳颗粒的适应证以及处方组成可以看出，清宣止咳颗粒适用于轻中型COVID-19患者的治疗。清宣止咳颗粒源自温病止咳名方“桑菊饮”，组方用药以轻药为主，药精量少、不伤正气，口感清甜、可增加儿童服药依从性，更适合小儿肺脏娇嫩的生理特点，是治疗小儿外感风热咳嗽之良方。既往的实验研究表明[18]，清宣止咳颗粒对急性支气管炎模型大鼠的病理损伤有修复和减轻其损伤作用，能增强大鼠细胞内杀菌作用，增加大鼠的白细胞移动指数，提高白细胞趋向化功能，对氨水刺激小鼠咳嗽具有较强镇咳作用，增加小鼠气管酚红排出量对气管酚红排出量。

从网络药理学分析结果可知，清宣止咳颗粒中Degree值最高的5个化合物均属于黄酮类成分，与目前临床推荐使用的西药进行对比，清宣止咳颗粒中核心活性化合物与新冠病毒3CL水解酶的结合能较为接近尤其是其单体成分山柰酚和木犀草素，结果与达原饮筛选的结果接近[19]。KEGG分析得出的与肺部最为相关的3条通路中均涉及PIK3CG、AKT1、CCND1和CASP9基因，且均是木犀草素的作用靶点。清宣止咳颗粒中核心活性成分是否通过作用于PIK3CG、AKT1等靶点调节小细胞肺癌通路、非小细胞肺癌通路和T细胞受体信号通路从起到抗COVID-19的作用需要进一步研究。

综上所述，本文利用网络药理学和分子对接技术对清宣止咳颗粒中化学成分、作用靶点和其核心活性化合物以及与新冠病毒结合能进行了探索性研究，从中可以看出清宣止咳颗粒治疗COVID-19是可以通过多成分、多靶点、多通路的协同作用来发挥疗效的。

参考文献

[1] Gorbalenya AE，Baker SC，Baric RS，et al.Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus：The species and its viruses-a statement of the Coronavirus Study Group [J/OL].BioRxiv，2020，DOI：10.1101/2020.02.07.937862.

[2]王玉光，齐文升，马家驹，等.新型冠状病毒（2019-nCoV）肺炎中医临床特征与辨证治疗初探[J].中医杂志，2020，61（4）：1-6.

[3]任婧昱，姜文红，曹飞，等.HPLC测定清宣止咳颗粒芍药苷、橙皮苷含量[J].黑龙江医药，2014，27（5）：1015-1017.

[4]Liu JF，Hu AN，Zan JF，et al.Network Pharmacology Deciphering Mechanisms of Volatiles of Wendan Granule for the Treatment of Alzheimer′s Disease[J].Evid Based Complement Alternat Med，2019，2019：7826769.

[5]Tang F，Tang Q，Tian Y，et al.Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of Mahuang Fuzi Xixin decoction for application to allergic rhinitis[J].J Ethnopharmacol，2015，176：402-412.

[6]赵丽琴，肖军海，李松.分子对接在基于结构药物设计中的应用[J].生物物理学报，2002，18（3）：263-270.

[7] Ru J，Li P，Wang J，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform，2014，6：13.

[8]Trends M，Chalifa-Caspi V，Prilusky J，et al.GeneCards：Integrating information about genes，proteins and diseases [J].Trends Genet，1997，13（4）：163.

[9]UniProt CT.UniProt：the universal protein knowledgebase[J].Nucleic Acids Res，2018，46（5）：2699.

[10] Huang dW，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J].Nat Protoc，2009，4（1）：44-57.

[11]Burley SK，Berman HM，Kleywegt GJ，et al.Protein Data Bank（PDB）：The Single Global Macromolecular Structure Archive[J].Methods Mol Biol，2017，1607：627-641.

[12]Smoot ME，Ono K，Ruscheinski J，et al.Cytoscape 2.8：new features for data integration and network visualization[J].Bioinformatics，2011，27（3）：431-432.

[13]Wang X，Shen Y，Wang S，et al.PharmMapper 2017 update：a web server for potential drug target identification with a comprehensive target pharmacophore database[J].Nucleic Acids Res，2017，45（W1）：W356-W360.

[14]Davis AP，Grondin CJ，Johnson RJ，et al.The Comparative Toxicogenomics Database：update 2017[J].Nucleic Acids Res，2017，45（D1）：D972-D978.

[15]宗阳，陈婷，董宏利，等.基于网络药理学四逆散治疗抑郁症的作用机制探讨[J].中草药，2019，50（20）：4995-5002.

[16]项琼，莫郑波，宋恩峰.新型冠状病毒肺炎中医理论与临床探讨[J/OL].医药导报，[2020-02-12].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/42.1293.R.20200212.2049.002.html.

[17]郑文科，张俊华，杨丰文，等.中医药防治新型冠状病毒感染的肺炎各地诊疗方案综合分析[J].中医杂志，2020，61（4）：277-280.

[18]阮斌，胡还甫，余林岚.清宣止咳颗粒对急性支气管炎模型大鼠的影响[J].首都医药，2010，17（6）：43-44.

[19]宗阳，丁美林，贾可可，等.基于网络药理学和分子对接法探寻达原饮治疗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）活性化合物的研究[J].中草药，2020，51（4）：836-844.

（2020-02-24收稿 責任编辑：王明）

基金项目：国家自然科学基金项目（81973445，81573554）;江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目（YY026）;苏州市“科教兴卫”青年课题（KJXW2019044）;苏州市科技局指导性课题（SYSD2019149）;苏州市中医医院院级科技计划项目（YQN2017004）作者简介：宗阳（1991.07—），男，硕士，中药师，研究方向：中药药效物质基础研究，E-mail：1181835152@qq.com通信作者：姚卫峰（1979.12—），男，博士，教授，硕士研究生导师，研究方向：中药药效物质基础研究，E-mail：yaowf@njucm.edu.cn