大肠杆菌疫苗对胎兔肺发育成熟的影响

翁增凤，陈 丽，陈光明

(联勤保障部队第九○○医院儿科 原解放军福州总医院，福建 福州 350025)

新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)又称新生儿肺透明膜病，是新生儿科急症，主要是肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)缺乏及肺结构发育不成熟所引起的[1-2]。前期，笔者团队发现宫内注射大肠杆菌(Escherichia coli，E.coil)疫苗诱导体液免疫应答后能够促进胎兔PS中主要构成成分磷脂的蛋白表达和生成，可能对胎兔肺的发育成熟具有潜在的积极作用。本研究通过观察大肠杆菌疫苗干预后胎兔肺结构和功能改变情况，旨在评价大肠杆菌疫苗是否能够促进胎兔肺发育成熟。

1 材料与方法

1.1 实验材料

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级新西兰大耳雌性白兔共20只，雄性白兔2只，体重(3.33±0.24)kg，购自上海市松江区松联实验动物场，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0011。大肠杆菌疫苗(成都天邦生物制品有限公司)。本研究通过医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 建模与分组

新西兰大耳雌性白兔发情后与雄兔自然交配，以交配后第1天定义为妊娠第1天。妊娠期间常规饮食。将妊娠兔随机分为两组，每组10只；大肠杆菌疫苗组于妊娠第10天、第17天和第24天，乙醚吸入麻醉后，用阴道扩张器暴露子宫颈，将大肠杆菌疫苗溶液用1mL注射器注射到子宫颈肌肉内，用药剂量为0.1mL·kg-1·d-1[3-4]；生理盐水组于妊娠第10天、第17天和第24天，乙醚吸入麻醉后，用阴道扩张器暴露子宫颈，注射部位及剂量同大肠杆菌疫苗组。

1.3 标本采集和观察指标

妊娠第27天用氯胺酮静脉注射麻醉后剖宫产，取胎兔用于：①观察胎兔自然存活时间；②测定胎兔肺压力-容积(pressure-volume，P-V)曲线：胎兔气管插管(用24G静脉留置针去掉金属针头作为气管导管)后连接带有刻度的玻璃瓶及玻璃管，利用玻璃管内液体高度产生压力梯度变化，先按10cm、20cm、30cm、40cm高度逐渐上升，后随40cm、30cm、20cm、10cm、0cm回降，每级稳定15s，记录相应压力下的胎兔肺容积；③胎兔肺组织光镜、电镜观察，肺干湿重比测量：光镜切片HE染色，观察肺组织病理改变；电镜切片3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜下观察肺超微结构改变；取左下肺尖1.0×1.0×1.0 cm大小肺组织进行干湿重比测量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组胎兔自然存活时间比较

大肠杆菌疫苗组胎兔存活时间明显高于生理盐水组，差异有统计学意义(t=9.53，P<0.01)，见表1。

表1 两组胎兔存活时间比较

2.2 两组胎兔肺P-V曲线比较

大肠杆菌组胎兔肺P-V曲线位于生理盐水组之上，当压力为30cmH2O、40cmH2O时大肠杆菌组肺容积显著大于生理盐水组(P<0.05)，见图1。

注：“*”表示与生理盐水组比较， P<0.05。

2.3 两组胎肺干湿重比

两组胎兔出生体质量和肺干重比较差异均无统计学意义(t=0.44、0.24，P>0.05)，大肠杆菌组胎兔肺湿重显著小于生理盐水组，胎兔肺干湿重比显著大于生理盐水组，差异均具有统计学意义(t=3.87、5.26，均P<0.01),见表2。

表2 两组胎兔肺干湿重比的比较情况

2.4 两组胎兔肺光镜组织病理学变化

生理盐水组光镜下可见部分肺泡塌陷，肺泡间壁相互贴近；大肠杆菌疫苗组可见肺泡扩张，结构完整,见图2。

注：A.大肠杆菌疫苗组；B.生理盐水组。

2.5 两组胎兔肺电镜病理超微结构改变

生理盐水组可见完整细胞核，板层体呈空泡化改变，线粒体肿胀，体积增大，细胞游离面仅有少许微绒毛，可见微绒毛脱落。大肠杆菌疫苗组可见完整细胞核，板层体较生理盐水组多，线粒体完整，可见内质网等细胞器，细胞游离面可见微绒毛,见图3。

注：Nu:细胞核；LB：板层体；Mi:线粒体；Er:内质网；Mv:微绒毛。A.大肠杆菌疫苗组；B.生理盐水组。

3 讨论

前期研究发现，辅助性T(helper T，Th)细胞在免疫系统中起重要作用，其中Th1细胞介导的炎症反应参与细胞免疫应答，对胎肺发育成熟产生不利影响；而接种细菌疫苗可刺激机体产生Th2细胞介导的体液免疫应答，可能对胎肺发育成熟产生积极作用[3-4]。本课题组前期的研究发现产前接种大肠杆菌疫苗可明显上调胎兔肺泡SP中磷脂生成和蛋白表达，但是，关于大肠杆菌疫苗宫内注射能够促进胎兔肺结构和功能发育成熟的直接证据仍然有限。

3.1 大肠杆菌疫苗对胎兔肺组织结构发育成熟的影响

本实验通过对孕兔宫内注射大肠杆菌疫苗和生理盐水进行干预，以此分别模拟诱导体液免疫应答和安慰剂对照。光镜下观察发现生理盐水组镜下可见部分肺泡塌陷，肺泡间壁相互贴近；而大肠杆菌组肺泡扩张，结构完整。电镜观察到生理盐水组板层体呈空泡化改变，线粒体肿胀，体积增大，细胞游离面仅有少许微绒毛，可见微绒毛脱落；而大肠杆菌组均可见完整细胞核，板层体数量较生理盐水组多，线粒体均完整，可见内质网等细胞器，细胞游离面可见微绒毛。板层体是肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cells type Ⅱ，AEC Ⅱ)内一种呈球形、内含同心圆或平行排列的板层结构，主要由磷脂、蛋白质和糖胺多糖构成，不仅是PS的贮存部位，也是PS的分泌颗粒，并以出胞的方式分泌PS，随着肺发育成熟，板层体数量逐渐增加，所以板层体数量侧面反应胎肺的成熟情况[5]。因此，本研究结果提示产前接种大肠杆菌疫苗诱导体液免疫应答可促进胎兔AEC Ⅱ发育、改善肺超微结构，对促进胎肺结构发育成熟具有一定作用。

3.2 大肠杆菌疫苗对胎兔肺功能发育成熟的影响

NRDS患儿由于PS不足、肺泡萎陷、肺顺应性下降、通气换气功能受损，导致肺毛细血管损伤和膜的通透性增加，大量血浆蛋白质和血管内水分漏入肺泡，出现肺水肿，严重者肺泡内的渗出液可形成一层“嗜依红透明膜”，引起急性低氧血症性呼吸衰竭[6-7]。本研究通过测绘两组胎兔肺P-V曲线，发现随着对胎兔肺外加压力的递增，大肠杆菌组胎兔肺容积明显大于生理盐水组，胎兔肺干湿重比明显大于生理盐水组。肺P-V曲线是反映肺顺应性的较好指标，与肺通气和换气功能具有显著相关性，肺干湿重比则能够反映肺水肿和肺损伤的程度，肺湿重越大表示肺组织含水量越大，在一定程度上反映了肺水肿和肺损伤的严重程度[8]。因此，本研究结果提示产前接种大肠杆菌疫苗可减轻肺泡萎陷，有利于肺泡保持扩张状态，从而能更好地保持功能残气量，有利于维护肺的气体交换功能。

综上所述，产前接种大肠杆菌疫苗诱导体液免疫应答可促进胎兔肺AEC Ⅱ发育、改善肺超微结构、促进胎兔肺发育，进而防止肺泡萎陷，促进肺泡扩张，增加肺容积，改善通气和换气功能，减轻肺泡内渗出，减轻肺水肿，最终延长胎兔的存活时间。提示产前接种大肠杆菌可能有利于减轻或防止NRDS发生，这也为预防早产儿NRDS的发生提供了新的思路。但关于炎症状态下改善胎肺AEC Ⅱ超微结构机制尚不明确，今后仍需大量研究去证实，为炎症诱导肺发育的安全性提供更多的实验依据。