一种国产龋活性培养基与标准培养基一致性及有效性的实验检测

VIVIEN FENG，张 羽，曹桂芝，吴日玥，陈 曦

近年来，儿童患龋明显呈上升态势，第四次全国口腔流行病学调查显示，全国3岁儿童的龋患率为50.8%，4岁儿童为63.6%，到了5岁则高达71.9%[1]。通过龋病风险预测，早期发现并采取预防措施是控制龋病的关键[2]。

龋病活性检测(caries activity tests, CAT)是早期检测龋病风险的实验室方法，目前应用较多的方法有检测变形链球菌数量、观察乳杆菌数量、观察菌群分解蔗糖程度、测试唾液缓冲能力等[3]。其中Cariostat龋活跃性试验法是通过培养细菌，观察培养基颜色变化从而判定致龋菌群生长及分解蔗糖的程度，预测机体对龋病的易感性。该方法对儿童群体操作相对简单，无特殊实验室要求，结果判定容易，成为应用于儿童龋易感性筛查中较为常用的判定龋活性的方法[4]。然而，由于进口龋活性检测产品成本较高且获得渠道有限，寻找简便易得的试剂盒，评估儿童患龋风险具有重要意义。

基于此，本研究的目的是通过比较一种国产培养基和日本标准培养基两种龋活性测试剂在检测细菌产酸方面的一致性、敏感性和准确性，借此评估国产龋活性培养基的有效性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

国产培养基：煜芽增菌培养基(滁洲瑞谷生物技术有限公司，安徽省滁洲市，中国，以下简称国产培养基)；日本Cariostat培养基(Dentsply Sirona K.K.,Tokyo, 日本，以下简称标准培养基)；脑心浸出液肉汤(Bacto Laboratories Pty Ltd,Liverpool, 英国)；胰蛋白胨大豆琼脂(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，青岛，中国)；革兰染色试剂(珠海贝索生物技术有限公司，珠海，中国)；氯化钠粉剂(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，青岛，中国)；0.9%氯化钠(国药集团化学试剂有限公司，上海，中国)；所采用的测试菌种为：变异链球菌UA159(Streptococcusmutans)；血链球菌ATCC10556(Streptococcussanguinis)；唾液链球菌ATCC25975(Streptococcussalivarius)；远缘链球菌ATCC6715(Streptococcussobrinus)；嗜酸乳杆菌ATCC4356(Lactobacillusacidophilus)；牙龈卟啉单胞菌ATCC33277(Porphyromonasgingivalis)；具核梭杆菌 ATCC25586(Fusobacteriumnucleatum)；黏性放线菌ATCC 27044(Actinomycesviscosus)。血链球菌及黏性放线菌标准菌株来源于上海哈灵生物科技有限公司，其余标准菌株均由上海交通大学附属第九人民医院口腔微生物实验室提供。

1.2 实验设计与方法

1.2.1 菌液的制备 上述8种细菌，接种于琼脂/血培养基，37 ℃厌氧复苏48 h，收集菌落做生化鉴定，确定为纯培养后分别由脑心浸液(Brian-heart-infusion, BHI)中培养24～48 h增菌，革兰染色后显微镜下观察并摄片，确保菌株无污染后，离心收集细菌后由0.9%生理盐水冲洗2次,将上述菌种分别置于紫外分光光度计540 nm处制备成紫外分光吸光度值在1.0±0.2的菌悬液。图1示显微镜下的8种菌株。

1.2.2 实验方法 菌悬液梯度稀释，用0.9%生理盐水(0.9%NS)将菌悬液按照不同比例进行稀释为4组：未稀释、1∶10、1∶100、1∶500。各浓度梯度的菌种重复4次。并设置0.9%生理盐水为空白对照组。

将上述稀释梯度及空白对照分别取100 μL加入至国产培养基及标准培养基中。37 ℃恒温培养48 h。依据产品说明书，在同一光源条件下，3名经过培训并且一致性良好的读数员采用盲法读数，即由试验者打乱培养基顺序后读数。

读数含义如下：0：阴性；1：较低患龋风险；2：中度患龋风险；3：高度患龋风险，其中0和1又记为0(低风险),2和3记为1(中高风险)。

1.3 统计学方法

使用SPSS 19.0统计软件包进行国产与标准培养基读数的卡方检验(计算Kappa值)，并计算准确率、敏感性、特异性，统计中显著性检验水平设为0.05。

2 结 果

本次国产培养基与标准培养基读数结果见表1。按照患龋的低风险和中高风险分别记为0和1，对读数重新编码，检查者1、2、3的Kappa值分别为0.803、0.785和0.832(P<0.001)(表2)；3名检查者汇总数据后Kappa值为0.807(P<0.001)(表3)。以标准培养基为准，国产培养基敏感性为94.7%，特异度为84.7%，准确率为90.1%。

表1 检查者原始读数汇总

表2 各检查者龋风险读数(重编码)

表3 检查者龋风险读数汇总(重编码)

3 讨 论

龋病是一种在多因素影响下，以细菌为主的牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病[5]。儿童龋病发病率高居儿童常发疾病的首位，根据我国第四次全国口腔健康流行病学调查报道显示，全国3～5岁年龄组乳牙患龋率为62.5%[1]，对儿童龋齿的预防显得尤为重要。

菌斑既是龋病的病因, 又是龋病发生的环境,其产酸能力大小是判断牙菌斑致龋力的重要指标之一,牙菌斑内的产酸代谢活动是产生龋病损害的直接原因[1-2,5]。

如今，致龋微生物作为龋发生的预测指标已经得到了认可，在致龋微生物中，变形链球菌和乳杆菌与龋病发生和进展的关系已非常明确[6]。对早期釉质龋的研究发现, 龋活跃人群的牙菌斑中变形链球菌、乳杆菌等产酸、耐酸力强的细菌含量较不活跃人群明显增高，其中变形链球菌的水平可以作为低龄儿童龋的预测指标[7-8]。通过多项对低龄儿童患龋的细菌学研究表明，患龋儿童菌斑中变形链球菌的检出率及变形链球菌占总链球菌的百分比均明显高于无龋儿童[9]。Cariostat是通过检测菌斑产酸能力来评估龋易感性的方法之一，菌斑中产酸致龋菌在试剂培养基内经恒温培养分解代谢蔗糖生成乳酸,使试剂中特定的pH 指示剂产生显色反应,显色变化能反映乳酸的生成量,由此推断采样标本中致龋菌的量及机体的龋病活跃性[4-5,10]。有研究显示Cariostat值在婴儿期已显示出和低龄儿童龋的显著相关性，对低龄儿童龋的发展起到早期预测作用[11-12]。以Cariostat为代表的龋易感性检测操作简便，结果准确且可多次重复，适宜应用于预测儿童患龋风险[13-14]。但由于进口检测试剂的渠道和价格的限制，在临床持续应用及群体筛查工作中并未普及。本次实验选择的国产培养基取样方法亦简便无损伤，与标准培养基的产品主要组成成分相似，均由胰蛋白胨、蔗糖、氯化钠、溴甲酚等组成，所培养的细菌以胰蛋白为氮源、以蔗糖为碳源、以溴甲酚为酸性显示剂，培养时产酸从而改变培养基的颜色[15-16]。

本实验选择的8种标准菌是口腔内的主要致病菌，除了常见的产酸、耐酸菌株如变形链球菌和嗜酸乳杆菌外，本次实验也选用了具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌等牙周致病菌。选择此类非产酸耐酸菌作为阴性对照，以验证国产培养基对于其他非酸性产物无阳性反应。但本实验只选用了8种标准菌株，而非混合菌斑，不能代表人体内菌斑的实际情况。今后应进一步检测两种培养基在检测体内混合菌斑方面的一致性，以提供更多数据。

针对两种培养基的实验读数，3名检查者所得到的Kappa值介于0.78～0.83，总Kappa值为0.8以上，证明国产培养基对于判断龋低危和中高危方面，是完全可靠的。但两种培养基还存在一定差异，推测可能的原因是：国产培养基与标准培养基组分近似，但各成分浓度的细微差异使得两种培养基培养出的致龋菌浓度仍存在一定差异。就本次实验结果看，国产培养基敏感性高于标准培养基，即国产培养基诊断得分普遍高于标准培养基，可以更敏感地识别有龋易感性的儿童，但相较于敏感度，其特异性尚显不足。今后仍需结合其他检测方法，用于大规模人口的筛查。

目前，龋活性实验主要用于流行病学调查中目标人群的筛查，要求所采用的试验方法简单、成本低廉。然而目前常用的进口龋活性检测产品成本较高,并且产品获得渠道受限,限制了国内相关研究的开展。此次实验旨在通过实验室的前期研究，检验国产培养基在检测细菌产酸方面的效果，为进一步推广使用国产培养基提供实验室的依据和数据。本次实验选择的国产培养基可能是一种非常有希望的替代品，但其是否能够准确预测龋易感性仍需进一步的针对人群的前瞻性研究。同时，科学准确评估患龋风险是儿童龋病预防中的重要一环。龋病为多因素致病疾病，国际常用龋风险评估体系都是多因素综合的系统，包括美国儿童牙科学会(AAPD)研发的Caries-riskAssessmentTool，美国加尼福利亚牙科协会研发的CariesManagementbyRiskAssessment；美国牙科协会(ADA)研发的Caries-riskAssessmentSystem；瑞典研发的cariogram等[17-20]。但上述龋风险评估体系不适用于国人，且单一预测方法尚无法准确预测龋病易感性，因此后续研究包括：继续寻求更多高准确度、高性价比、易获取的实验产品(如唾液流速相关产品、唾液缓冲能力检测产品等)；建立健全适用于我国儿童的，综合临床检查、病史、口腔细菌环境等多因素的龋病风险评估系统，更好地为我国人群的龋病预防服务。